Adressage intracellulaire d'anticorps à simple domaine spécifiques pour la protéine Tau – NanoTarget

La première étape importante de NanoTarget a consisté en l’ingénierie génétique et chimique des nanocorps spécifiques de la protéine tau, ainsi qu’en leur production à l’aide de la technologie de l’ADN recombinant en bactéries. Dans le cadre de NanoTarget, nous avons conçu cinq nouvelles constructions pour la production recombinante de nanocorps, permettant des modifications faciles aux extrémités N- et C-terminales. La combinaison de modifications N- et C-terminales offre de multiples possibilités de ciblage et de suivi, fournissant ainsi de nouveaux outils pour ce projet et d’autres.

- À l’extrémité C-terminale, un résidu cystéine a été codé dans la construction. Ce résidu cystéine permet la conjugaison de diverses molécules ou de peptides synthétiques grâce à la chimie du soufre. L’ajout d’un Avi-tag à l’extrémité C-terminale permet une biotinylation ciblée via l’enzyme BirA.

- À l’extrémité N-terminale, nous avons conçu un site de protéase TEV. Cela génère des résidus de glycine N-terminaux qui peuvent être fonctionnalisés avec un peptide (par exemple avec un fluorophore). Le site de clivage TEV N-terminal est essentiel pour modifier facilement le nanocorps à l’aide de l’enzyme sortase, qui peut lier divers peptides synthétiques au résidu de glycine libéré par le clivage TEV. Un signal de localisation nucléaire N-terminal a été ajouté à certaines constructions afin de permettre le ciblage des Nbs vers le noyau.

Ces modifications présentent un intérêt pour la recherche visant à développer des applications diagnostiques et thérapeutiques.

Au départ, le peptide pénétrant dans les cellules était fixé par une réaction chimique à base de soufre à l’extrémité C-terminale du nanocorps. Cependant, au cours de ce projet, le partenaire 1 a développé une nouvelle méthodologie de marquage appelée Bio-RAM, qui permet la modification des résidus de lysine à la surface du nanocorps. Cela permet des fixations multiples et réduit la dose nécessaire à l’internalisation cellulaire. La conservation de la capacité de liaison du nanocorps modifié spécifique de la protéine tau a été vérifiée par spectroscopie de résonance plasmonique de surface.

Les nanocorps produits ont ensuite été purifiés à l’aide du His-tag attaché, qui est clivé par la protéase TEV puis éliminé par une chromatographie d’affinité supplémentaire sur résine chélatrice de métaux. Des enzymes de modification telles que la sortase ont également été produites dans E. coli et purifiées en laboratoire.

Des tests d’absorption cellulaire ont été réalisés sur des cellules HeLa et MCF7, ainsi que sur des cultures primaires de souris. L’absorption a été suivie par microscopie à fluorescence grâce aux marqueurs fixés.

Afin d’évaluer et de suivre l’absorption cellulaire, les nanocorps ont été marqués avec un fluorophore à un site spécifique à l’aide d’une réaction médiée par l'enzyme sortase à l’extrémité N-terminale du nanocorps.

La conjugaison de peptides pénétrants les cellules (CPP) riches en arginine à des nanocorps spécifiques de la protéine tau a amélioré l’acheminement intracellulaire des protéines à travers la membrane plasmique. La conjugaison des nanocorps anti-tau avec des peptides pénétrants les cellules a été réalisée avec succès à l’aide de la stratégie BioReversible Arginine Modification (BioRAM), récemment publiée. Cette approche permet de modifier les amines à l’aide de peptides courts contenant de l’arginine. Elle permet un clivage rapide des peptides pénétrants cellulaires à l’intérieur des cellules et empêche la protéine délivrée de rester piégée localement. Nous avons ensuite montré l’absorption dans des cellules HELA et MCF7. Ce résultat a été validé par la quantification de la fluorescence émise par le nanocorps fonctionnalisé. Ensuite, l'expérience a été réalisé dans des cultures de neurones hippocampiques primaires de souris. Le protocole de fonctionnalisation optimisé, basé sur l’approche bio-RAM, a été adopté. Ce protocole comprend l’ajout d’un additif développé dans le laboratoire du partenaire 1. Les résultats ont montré que les cellules neuronales absorbaient le nanocorps fonctionnalisé à faible concentration, sans toxicité cellulaire.

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Au cours de ces expériences, nous avons observé que les nanocorps sans peptide pénétrant cellulaire n’étaient pas absorbés par les cellules neuronales elles-mêmes, même en présence de protéine tau dans l’espace extracellulaire. Ces expériences, initialement réalisées comme des contrôles, ont révélé que certains des nanocorps bloquaient l’absorption de la protéine tau.

Des recherches plus approfondies ont montré que ce phénomène dépendait principalement de l’épitope de la protéine tau lié. Nous avons proposé un mécanisme selon lequel les nanocorps spécifiques de la protéine tau entrent en compétition avec les récepteurs de surface cellulaire. Nous avons démontré que la protéine tau soluble est principalement absorbée par le récepteur LRP1, et que la liaison des nanocorps à la région centrale de la protéine tau inhibe cette absorption. L’absorption des fibrilles de protéine tau semble quand à elle médiée par l’héparine de surface cellulaire.

Le nanocorps H3-2 s’est avéré le plus efficace pour bloquer ces deux processus et s’est révélé posséder une configuration dimérique unique, comme montre sa structure cristalline et une validation supplémentaire en solution.

La combinaison de modifications génétiques et chimiques que nous avons mis au point s'avère extrêmement intéressante pour de nombreuses applications de recherche.

- la conjugaison des nanocorps à des sondes fluorescentes et à la biotine nous ont permis de développer de nouveaux outils de détection de la protéine tau pour le Western blot et la microscopie. La cystéine C-terminale a été utilisée pour une conjugaison orientée sur des billes d’or afin de marquer les fibrilles de protéine tau par microscopie électronique à transmission.

- D’autres études ont utilisé des nanocorps fonctionnalisés spécifiques à la protéine tau, en tirant parti de la cystéine C-terminale du nanocorps. Des billes fonctionnalisées ont été préparées et utilisées pour immunoprécipiter des fragments de protéine tau à partir de vésicules extracellulaires purifiées de cerveaux, démontrant ainsi la présence de fragments de tau dans ces vésicules. Ces vésicules jouent un rôle dans le transfert de la protéine tau entre les neurones et potentiellement dans la propagation de la pathologie dans le cerveau dans la maladie d'Alzheimer. Ces résultats fondamentaux sont donc importants dans le développement de thérapies et de diagnostics.

Dans le cadre du projet européen TAME , nous exploitons certains des développements de NanoTarget. Nous travaillons notamment en collaboration dans le domaine du diagnostic de la maladie d'Alzheimer.

- Par exemple, nous prévoyons d’étudier la fixation d’un radionucléotide pour marquer les fibrilles de protéine tau en vue d’une imagerie par tomographie par émission de positons, en collaboration avec l’Université de Liège. La conjugaison via la cystéine C-terminale (conçue dans le cadre de NanoTarget) nécessite d’abord la réduction de la liaison disulfure sans affecter la liaison disulfure interne présente dans toutes les nanocorps et nécessaire à leur stabilité. Nous testons différents agents réducteurs afin d’obtenir une conjugaison avec un rendement élevé (au moins 80 %). Cela est nécessaire compte tenu du coût élevé de production du radionucléide (18F), qui est utilisé pour préparer le bioconjugué destiné à la tomographie par émission de positons.

- La biotinylation des nanocorps, permet d’utiliser la technique SIMOA pour détecter potentiellement la protéine tau dans les fluides biologiques à l’aide de nanocorps spécifiques à la tau pour développer des kits de diagnostic sanguin. Ces travaux sont menés en collaboration avec des laboratoires de renom des universités d’Amsterdam et de Göteborg, réputés pour avoir développé de tels dosages jusqu’au stade clinique.

Tau est un acteur physiopathologique dans les cancers et les maladies neurodégénératives, et globalement une cible thérapeutique. Tau est principalement connue comme une protéine associée aux microtubules qui s'agrège en filaments conduisant à une neurodégénérescence dans des conditions pathologiques appelées tauopathies. En plus de la dynamique des microtubules, un autre rôle physiologique de Tau est nucléaire, conférant protection et réparation aux dommages causés à l'ADN. Malheureusement, Tau est ré-exprimé dans certains cancers conduisant à une résistance à la chimio / radiothérapie. Dans le cancer et les tauopathies, il y a donc un objectif commun qui est d'interférer avec les liaisons de Tau. Ainsi, NanoTarget vise à développer des outils thérapeutiques (fragments d'anticorps ou nanobodies (Nbs)) modulant la liaison de Tau à ses partenaires.

Nous appliquerons nos expertises dans la génération de conjugués de Nbs et l'évaluation biologique de formats de ces fragments d’anticorps pénétrants les cellules pour cibler la protéine Tau dans les cellules vivantes, y compris les neurones. Au sein de NanoTarget, nous allons render possible es applications liées à diverses maladies, en particulier le cancer et la neurodégénérescence, nécessitant la délivrance des Nbs à un endroit précis à l'intérieur de la cellule, pour atteindre le cœur de la pathologie. En effet, les Nbs fonctionnalisés spécifiques de Tau pourraient empêcher l'auto-association de Tau à l'intérieur des neurones dans une série de pathologies apparentées appelées tauopathies. De plus, nous souhaitons capitaliser sur notre capacité à moduler la fonction Tau et la délivrance de Nbs à un compartiment sub-cellulaire spécifique, en interférant avec les fonctions nucléaires Tau, dans de nouvelles applications liées à la recherche sur le cancer. Ainsi, l'objectif de NanoTarget est de fournir de nouvelles modalités basées sur les Nbs spécifiques à Tau en tant qu'outils de recherche biomédicale et que nouveaux composés biopharmaceutiques.

Des fragments d’anticorps, tels que les Nbs, offrent un énorme potentiel de traitement grâce à leurs propriétés. Les Nbs sont intéressants pour les cibles intracellulaires, y compris nucléaires, qui ne peuvent être atteintes par les approches IgG conventionnelles. Pour être efficaces dans ce contexte, les Nbs doivent pénétrer dans les cellules, y compris les neurones, et atteindre le compartiment sub-cellulaire requis tout en préservant l'affinité et la spécificité pour leur cible. NanoTarget vise à poursuivre nos recherches dans le domaine hautement compétitif des tauopathies mais aussi à prolonger nos avancées originales dans le domaine du cancer.

Le potentiel d'atteindre Tau à l'intérieur des cellules avec des approches immunologiques a été jusqu’ici peu considéré. La délivrance intracellulaire de protéines fonctionnelles dans les cellules vivantes, qui est essentielle pour NanoTarget, est en effet une tâche difficile en sciences biomédicales, mais extrêmement puissante pour le développement de nouveaux médicaments. L'expertise documentée en chimie des protéines (Partenaire 1, Ge), biologie structurale (Partenaire 2, Fr) et en biologie cellulaire (Partenaire 3, Fr) des partenaires, leur expérience avérée dans la recherche sur Tau, ainsi que leurs collaborations fructueuses antérieures sont indéniablement la clé pour atteindre cet objectif ambitieux.
Nous visons à fournir des Nbs fonctionnalisés spécifiques de Tau liant efficacement Tau à l'intérieur des cellules, y compris les neurones, dans le compartiment cytosolique ou nucléaire. Ces Nbs spécifiques de Tau seront conçus pour permettre le suivi de leur localisation dans les cellules, fournissant de nouveaux outils pour la recherche biomédicale. Ces Nbs spécifiques de Tau, pénétrant dans les cellules, auront également le potentiel d'être développés en tant que produits biopharmaceutiques à long terme dans un large éventail de pathologies liées à Tau.