Le rôle des lipides dans le contrôle spatiotemporel et la coordination de la division cellulaire chez Arabidopsis. – DivFUSE

Dans ce projet, nous allons traiter la question de comment les lipides and des protéines clés du trafic intracellulaire régulent l’insertion de la plaque cellulaire en déployant une combinaison unique d’outils génétiques, de biologie cellulaire et de biochimie. Ces outils comprennent des biosenseurs de lipides, de la chimie click des lipides, la déplétion inductible de lipides par de l’optogénétique, de la microscopie confocale à super-résolution, de l’immuno-purification de complexes membranaires ciblés et de la protéomique et lipidomique de pointe.

Nous étudions l'environnement lipidique du complexe TRAPPII dans les pointes racinaires d'Arabidopsis en caractérisant la localisation spatio-temporelle des phosphoinositides avec la sous-unité TRS120 au niveau de la plaque cellulaire à l'aide de l'imagerie spinning-disk deux couleurs. La localisation subcellulaire des acteurs protéiques et lipidiques cités ci-dessus, et qui sont impliqués dans le ciblage du site de fusion de la plaque cellulaire à la membrane plasmique, est un environnement dense qui nécessite des approches de microscopie à super-résolution afin d’en discerner les différents éléments. Par exemple, la co-localisation entre SAC9 et TRAPPII a été explorée à l'aide de la microscopie à super-résolution dite d’expansion (ExM) qui permets d’atteindre une résolution d’environ 50 nm en x-y et qui permets de réaliser des acquisitions 3D.

De plus, alors que nous disposons d’outils permettant de visualiser les phosphoinositides, par approches biosenseurs, nous ne disposons à l’heure actuelle d’aucun outils pour la visualisation des sphingolipides chez les plantes. Nous développons une approche de click-chemistry afin de visualiser le pool total de sphingolipides, cette approche est également compatible avec la microscopie à super-résolution ExM. Nous allons donc pouvoir prochainement co-localiser les sphingolipides avec les éléments protéiques de la cytocinèse et ce à super-résolution.

Enfin, nous déployons des approches de lipidomique afin de caractériser la composition lipidique exacte de l’environnement membranaire du complexe TRAPPII. Nous nous focalisons sur les phospholipides classiques, les phospholipides anioniques ainsi que les sphingolipides. Ces approches utilisent principalement des méthodes de chromatographie en phase liquide couplées à de la spectrométrie de masse (LC-MS/MS).

Nos résultats montrent que le complexe TRAPPII est localisé au phragmoplaste, ainsi que SAC9 et MAP65-3. SAC9 est enrichi au bord du phragmoplaste, entraînant la déplétion du PI(4,5)P2. Nous avons quantifié que le biosenseur de PI(4,5)P2 est significativement appauvri au bord du phragmoplaste alors que TRS120-GFP est enrichi. L'ensemble de ces résultats suggère que SAC9 et le complexe TRAPPII agissent de concert au niveau des bords du phragmoplaste en ciblant TRAPPII sur la zone d'appauvrissement en PI(4,5)P2 où se localise SAC9. De plus, nous avons observé un enrichissement du phosphoinositide PI4P au milieu du phragmoplaste. Étant donné que SAC9 hydrolyse le PI4,5P2 pour produire du PI4P, nous pensons que SAC9 alimente le pool de PI4P au milieu de la plaque cellulaire en épuisant le PI4,5P2 sur les bords. Alternativement, l'enrichissement en PI4P au milieu de la plaque cellulaire illustre l'incorporation de vésicules enrichies en PI4P. L'enrichissement en PI4P au niveau de la plaque cellulaire pourrait avoir un rôle à jouer dans le ciblage du site de fusion de la plaque cellulaire avec la membrane plasmique, puisque nous avons observé qu'une déplétion en PI4P entraîne une mauvaise localisation de TRAPPII dans les corps intracellulaires.

Comme nos résultats préliminaires indiquaient que les acides gras à très longue chaîne (AGTLC) des lipides étaient impliqués dans la régulation de la quantité de PI4,5P2, nous avons réalisé une imagerie airyscan à haute résolution du complexe SAC9 et TRAPPII lors de traitements pharmacologiques qui réduisent la longueur des chaînes acyles des lipides. Nos résultats ont montré que la localisation de SAC9 et TRAPPII aux bords de la plaque cellulaire est dépendante des AGTLC. En outre, comme nous savons que les sphingolipides contiennent une proportion élevée d'AGTLC, nous avons tenté d'adapter la visualisation des sphingolipides par click-chemistry chez les plantes. Nos résultats montrent que cette approche marche dans les cellules végétales fixées. Dans l'ensemble, nos données montrent que SAC9 et TRAPPII sont enrichis sur les bords de la plaque cellulaire, et ceci est dépendent des sphingolipides, pour contrôler la localisation précise de l'insertion de la plaque cellulaire dans la membrane plasmique.

Nos résultats suggèrent que SAC9 et TRAPPII forment un complexe macromoléculaire aux bords de la plaque cellulaire mais leur interaction physique nécessite d’être confirmée et les mécanismes moléculaires qui régissent leur recrutement à élucider. La capacité des lipides anioniques à recruter le complexe TRAPPII au niveau des membranes est actuellement testée, comme par exemple pour le PI4P qui lorsqu’il est dégradé conduit à l'accumulation de TRAPPII dans des corps intracellulaires. Cependant, il reste à déterminer si ces corps s'associent à des compartiments tels que les endosomes car whez les plantes, le PI4P se localise à fois à la membrane plasmique, les endosomes et l'appareil de Golgi. Par ailleurs, ces corps pourraient résulter de la solubilisation des charges négatives après dégradation des lipides anioniques à la membrane plasmique, influençant l'association membranaire de TRAPPII au TGN.

Actuellement, nous utilisons des biosenseurs fluorescents pour localiser précisément les lipides anioniques au niveau du plan de division cellulaire. Cependant, la résolution obtenue par un microscope confocal conventionnel est limitée à environ 200 nm ou 160 nm au mieux pour la microscopie airyscan. C'est pourquoi nous utilisons actuellement la microscopie d'expansion (ExM) à super-résolution qui peut atteindre une résolution d'environ 60 nm lorsqu'elle est combinée à l'airyscan. Dans un avenir proche, nous produirons des images 3D de l'insertion des plaques cellulaires à la membrane plasmique en utilisant des marqueurs fluorescents ou des biosenseurs de TRAPPII, SAC9 et des phospholipides anioniques. Par ailleurs, nous ne disposons pas encore d'outils pour visualiser les sphingolipides dans les tissus végétaux. Nous développons actuellement la visualisation des sphingolipides par click-chemistry et cela nous donne de très bons résultats. A l'avenir, nous combinerons donc la click-chemistry à l'ExM pour obtenir une carte en super-résolution de la distribution des sphingolipides au niveau du site d'insertion de la plaque cellulaire. Enfin, nous caractériserons biochimiquement l'environnement du complexe TRAPPII par LC-MS/MS avec une priorité sur la caractérisation de la composition en phospholipides anioniques puis en sphingolipides.

Chez les plantes, la mise en place des patrons de développement est en partie dépendante de l’établissement du plan de division cellulaire, de la biogenèse d’un nouveau compartiment membranaire appelé la plaque cellulaire, de son expansion et de son insertion au niveau du site de division. Il est généralement reconnu qu’un repère est déposé à la membrane plasmique avant la prophase, et que les bords en expansion de la plaque cellulaire sont guidés vers ce repère à la fin de la division cellulaire. La nature de cette marque positionnelle reste évasive et les mécanismes qui guident la plaque cellulaire et qui permettent son insertion à la membrane plasmique ne sont pas bien compris. Les lipides sont de plus reconnus comme jouant le rôle de repères importants au sein des membranes mais la question de savoir si des lipides spécifiques marquent le site de division reste à explorer totalement. De manière intéressante, l’inhibition de la synthèse des phosphoinositides, des stérols ou des acides gras à très longues chaînes, un composant essentiel des sphingolipides, provoque des défauts de division cellulaire.
Nos résultats préliminaires indiquent que les phosphoinositides appelés PI(4,5)P2, ainsi que leur phosphatase SAC9, sont impliqués dans la définition de la localisation spatiale du site d’insertion de la plaque cellulaire. La répartition sub-cellulaire des PI(4,5)P2 semble être contrôlée par des interactions homéostatique entre lipides. En effet, nous avons trouvé que la longueur des chaînes acyles des sphingolipides est impliquée dans la régulation de la quantité de PI(4,5)P2 et que les sphingolipides sont localisés à la plaque cellulaire. Chez les animaux, des combinaisons spécifiques entre certains phosphoinositides et certaines Rab GTPase permettent de maintenir et coordonner des voies de trafic intracellulaire qui s’entrecoupent. Nos données préliminaires suggèrent que chez les plantes, les GTPase Rab-E jouent un rôle dans l’insertion de la plaque cellulaire. De plus, nous proposons que les GTPase Rab-E sont régulées par le complexe d’ancrage TRAPPII, un putatif facteur d’échange de la Guanine. TRAPPII joue un rôle pivot dans le contrôle spatiotemporel de la division cellulaire chez les plantes.
Dans ce projet, nous allons traiter la question de comment les lipides and des protéines clés du trafic intracellulaire régulent l’insertion de la plaque cellulaire en déployant une combinaison unique d’outils génétiques, de biologie cellulaire et de biochimie. Ces outils comprennent des biosenseurs de lipides, de la chimie click des lipides, la déplétion inductible de lipides par de l’optogénétique, de la microscopie confocale à super-résolution, de l’immuno-purification de complexes membranaires ciblés et de la protéomique et lipidomique de pointe. Notre projet se structure autour de trois principaux ensemble de tâches, chacun d’entre eux implique tous les partenaires. Ces axes traitent les questions suivantes : i) comment les lipides sont-ils triés afin de les localiser au bord en expansion de la plaque cellulaire ou au site de division de la membrane plasmique ? ii) Est-ce que le tri des lipides nécessite le module constitué par TRAPPII et les GTPase Rab-E ? iii) réciproquement, est-ce que les repères lipidiques régulent la fonction du module TRAPPII/GTPase RabE ?
Dans l’ensemble, notre projet propose de rassembler une expertise unique et reconnue internationalement dans la recherche de pointe en biologie cellulaire végétale, en biologie des lipides membranaires et en biochimie. L’aboutissement de ce projet permettra de placer notre consortium à l’avant-garde des découvertes sur la question de l’établissement des patrons géométriques cellulaires par l’intermédiaire de la division cellulaire, un processus essentiel à la croissance et au développement des plantes. De plus, la production de nouveaux outils et de ressources génétiques dans le cadre de ce projet sera utile à toute la communauté des biologistes cellulaires.