Régulation redox de la photosynthèse dans une cellule de microalgue révélée par la Résonance Magnétique Nucléaire en temps réel – PhotOxIN

Le projet a consisté en une approche intégrée structure-fonction de la protéine modèle CP12.

Grâce à l’étude des propriétés physiologiques des mutants de délétion de la protéine CP12 chez l’organisme modèle Chlamydomonas reinhardtii, de nouvelles fonctions de cette protéine ont été identifiées. En plus des conditions d’adaptation à la lumière ou à l’obscurité, l’adaptation des souches sauvages et mutantes à des variations de la pression partielle de CO₂ a été suivie, ce qui était inédit. La quantification de métabolites ciblés du cycle RPP a permis d’élucider certaines fonctions de la CP12. Une approche non ciblée de protéomique quantitative a révélé l’ensemble des voies métaboliques sensibles à la régulation du cycle RPP par la CP12. Enfin, les partenaires d’interaction de la CP12 ont été identifiés par des approches d’affinité non ciblées, et les interactions ont été confirmées par des approches de biophysique ciblées.

En parallèle, les propriétés structurales de la protéine dans différents milieux, dont les propriétés physico-chimiques miment les transitions rencontrées dans le chloroplaste, ont été étudiées par résonance magnétique nucléaire (RMN). La RMN offre l’avantage d’être non destructive, et, dans le cas de la RMN hétéronucléaire, d’être sélective. Cette approche a permis d’observer les transitions structurales de la protéine sélectivement enrichie avec l’isotope ¹⁵N dans des milieux complexes, qui miment l’environnement chloroplastique, tels que des extraits cellulaires de microalgues ou même des cellules procaryotes.

La RMN dans des milieux complexes nécessite de relever plusieurs défis, notamment liés à l’hétérogénéité du milieu ainsi qu’à l’organisation supramoléculaire. Grâce à des approches de mesure de diffusion translationnelle (DOSY-NMR, Diffusion Ordered NMR Spectroscopy), les organisations supramoléculaires dans un milieu réactionnel ont pu être identifiées.

Dans la perspective de sonder les propriétés moléculaires des protéines régulatrices dans des cellules dont l’état physiologique est parfaitement contrôlé, un couplage entre le spectromètre RMN et les bioréacteurs a été mis en place.

La quantification ciblée des métabolites du cycle des RPP et la protéomique quantitative sur de la biomasse de souches sauvages ou mutantes délétées pour la protéine CP12 ont permis de montrer que la CP12 stabilise la quantité de PRK ainsi que celle de son substrat, le ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP). Ce dernier est également le substrat de la RuBisCO, responsable de l’étape de carboxylation du RuBP, et in fine de la fixation du CO₂. L’absence de CP12 conduit également à un re-routage complet des voies métaboliques énergétiques centrales de C. reinhardtii, incluant les cycles des glyoxylates et du TCA. Bien que la quantité de RuBisCO ne soit pas affectée par l’absence de CP12, sa localisation est largement modifiée.

En particulier, chez la souche sauvage, la RuBisCO est distribuée entre deux compartiments dans des proportions variables. En conditions de haute pCO₂, une grande proportion de RuBisCO est diffuse dans le stroma du chloroplaste, tandis qu’une faible proportion est condensée dans le pyrénoïde. À faible pCO₂, ces deux proportions sont inversées, avec une majorité de RuBisCO condensée dans le pyrénoïde. Le changement de distribution de la RuBisCO entre le stroma et le pyrénoïde est aboli chez le mutant de délétion. Il semble donc que la CP12 ait une fonction de régulation qui va au-delà des simples interactions moléculaires CP12-PRK (Figure 1). Ces résultats sont détaillés dans deux publications (Gérard et al., 2026 ; Gérard et al., 2022).

L’adaptation à différentes conditions de luminosité et de pCO₂ conduit à des transitions des paramètres physico-chimiques dans le chloroplaste. Nous avions déjà démontré, avant le projet PhotOxIN, que les propriétés structurales de la CP12, et donc son affinité pour ses partenaires GAPDH et PRK, étaient modulées par le potentiel redox de son environnement (Launay et al., 2021 ; Launay et al., 2018). Grâce à des approches de RMN, nous avons démontré, lors du projet PhotOxIN, que les propriétés structurales de la CP12 sont très sensibles à la charge ionique et au pH (Figure 2). Ces données seront publiées prochainement.

L’analyse des propriétés physico-chimiques de la CP12 dans des cellules procaryotes a nécessité le développement de nouveaux outils pour la RMN en milieu complexe. Pour acquérir cette expertise, nous avons d’abord élucidé l’organisation supramoléculaire d’un milieu plus simple qu’une cellule mais hétérogène : des micelles mixtes de lipides reconstituées. Nous avons utilisé la DOSY-RMN pour documenter la réorganisation des micelles mixtes lorsque des monogalactosyldiacylglycérols sont hydrolysés par une galactolipase pour produire des monogalactosylmonoacylglycérols, des monogalactosylglycérols et des acides gras libres. Ces travaux sont publiés (Sahaka et al., 2024).

Une perspective du projet PhotOxIN est de déterminer les propriétés structurales de la protéine in situ dans le chloroplaste de C. reinhardtii dans différentes conditions de culture (aérobie/anaérobie, lumière/obscurité, pCO₂ élevée/basse, etc.). Pour réaliser cette étude, il a fallu mettre en place la RMN en milieu complexe. Nous avons couplé le spectromètre RMN 600 MHz de l’institut avec un photobioréacteur afin de garantir les conditions physiologiques de culture de C. reinhardtii. Le suivi des acides organiques dans le milieu de culture, assimilés ou sécrétés, nous permet d’avoir un contrôle in situ du métabolisme de C. reinhardtii (Figure 3). Ces travaux seront publiés prochainement et nous ont permis de suivre les lipides intracellulaires, qui s’accumulent sous forme de gouttelettes de triacylglycérols.

L’expertise du suivi in situ du métabolisme des microalgues en bioréacteurs ouvre de nombreuses perspectives. En effet, aujourd’hui, la montée en échelle des cultures en bioréacteurs est confrontée à un défi lié à l’absence de contrôle du métabolisme. Les retour d’expériences indiquent que la production de la biomasse ne corrèle pas avec l’augmentation de la taille des bioréacteurs. L’utilisation de la RMN non destructive apporte des informations rapides et in situ sur les différentes voies métaboliques activée ou pas, complémentaires à d’autres outils analytiques de type HPLC.

Forts de cette expertise, nous avons pour objectif d’élucider les propriétés structurales des biomolécules intracellulaires, en particulier les protéines dans leur cellule hôte maintenue dans des conditions physiologiques pertinentes. Grâce à la collaboration avec l’équipe du Dr. Eonseon Jin, nous avons exploité des souches de C. reinhardtii transformées avec un plasmide codant pour la CP12 sous le contrôle du promoteur sensible à la lumière LIP (Baek et al., 2018) pour produire des cellules de C. reinhardtii encapsulant des protéines ¹⁵N-CP12 observables par RMN. Ces travaux préliminaires indiquent qu’il faut optimiser la quantité de ¹⁵N-CP12 produite ainsi que la sélectivité du marquage isotopique.

L’assimilation du CO2 par le cycle de Calvin Benson Basham (CBB) est dépendante de la lumière et de la disponibilité d’ATP et NADPH produits lors les phases photochimiques de la photosynthèse. Elle est inhibée à l’obscurité par l’oxydation des groupement thiols de certaines enzymes, un changement du pH dans le stroma du chloroplaste et des interactions protéines-protéines. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation d’enzymes du cycle CBB en tenant compte des nouveaux réseaux de transfert d’électrons récemment décrit et de l’environnement multiphasique du chloroplaste. En particulier, la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) et la phosphoribulokinase (PRK) sont inhibées à l’obscurité par la formation d’un complexe ternaire avec une protéine médiateur redox, CP12. A la lumière, la protéine CP12 est désordonnée, le complexe se dissocie, et d’autre fonctions sont proposées pour la CP12 sur la base d’études in vivo. Bien que très solubles dans l’eau, les enzymes du cycle CBB sont localisées à proximité des membranes thylakoïdes et pourraient être influencées par l’encombrement moléculaire ou le confinement spatial. Il est donc nécessaire de tenir compte de l’environnement physico-chimique très encombré du chloroplaste pour étudier la régulation du cycle CBB. Nous proposons d’utiliser la RMN pour étudier les propriétés et transitions structurales de la CP12 dans le contexte cellulaire de la microalgue modèle Chlamydomonas reinhardtii. Afin de corréler ces transitions structurales au fonctionnement du cycle, des métabolites spécifiques du cycle seront également suivies par RMN haute résolution à l’angle magique (HR-MAS NMR). Ce tandem structure / métabolisme sera étudié à l’obscurité, à la lumière et lors de transitions obscurité/lumière grâce à des méthodes de RMN ultra-rapides.