Mitochondrial DNA Damage Response – MIT2DR

Le projet MIT2DR adoptera une approche intégrée combinant génétique, ingénierie ciblée du génome mitochondrial, analyses multi-omiques, biochimie et imagerie afin de décrypter les mécanismes cellulaires activés en réponse aux dommages de l’ADN mitochondrial (mtDNA).

Une première série d’expériences reposera sur des mutants d’Arabidopsis affectés dans la maintenance et la réparation du mtDNA, servant de modèles d’instabilité chronique, et l’induction contrôlée de lésions du mtDNA grâce à des nucléases TALEN ciblées vers les mitochondries. Ces outils permettront de générer des dommages localisés et reproductibles afin de caractériser les réponses précoces déclenchées par l’altération de l’intégrité du génome mitochondrial.

Les conséquences moléculaires des dommages seront étudiées par des approches de transcriptomique afin d’identifier les réseaux de gènes activés lors de la réponse aux lésions et/ou à l’instabilité du mtDNA. Ces données seront intégrées à des analyses épigénomiques visant à caractériser les modifications de la chromatine et les changements de méthylation associés aux programmes transcriptionnels induits. Cette approche permettra de relier les signaux émis par les mitochondries aux mécanismes nucléaires contrôlant l’expression génique.

Afin d’identifier les voies de signalisation impliquées, le projet exploitera des lignées rapporteurs fluorescentes permettant de suivre la dynamique des ROS, les capacités de détoxification et l’état redox cellulaire. Des approches de cytologie quantitative et d’imagerie seront mobilisées pour analyser les effets sur la progression du cycle cellulaire, la prolifération et le développement.

Enfin, une stratégie de crible génétique sera mise en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la signalisation induite par les dommages du mtDNA. Les mutants suppresseurs ou modificateurs identifiés feront l’objet d’analyses fonctionnelles afin de reconstruire les réseaux moléculaires reliant l’intégrité du génome mitochondrial, la signalisation rétrograde et l’adaptation cellulaire.

Cette combinaison d’approches complémentaires permettra d’établir une vision mécanistique intégrée de la réponse aux dommages de l’ADN mitochondrial et de son rôle dans le contrôle du développement et de l’adaptation des plantes.

L’utilisation de mutants présentant une instabilité du génome mitochondrial (radA, oex1) ainsi que de lignées mitoTALEN constitutives et inductibles a permis d’étudier les réponses rétrogrades déclenchées par des dommages au mtDNA dans différents contextes expérimentaux.

Les mutants radA et oex1, affectés dans la maintenance et la réparation du mtDNA (recombinaison homologue et excision de base), présentent des réarrangements du génome mitochondrial liés à la réparation de cassures double brin. À l’inverse, les lignées mitoTALEN permettent d’induire des cassures ciblées et d’analyser les réponses précoces en limitant les effets secondaires liés aux réarrangements accumulés.

1- Les analyses du méristème racinaire montrent qu’une instabilité du mtDNA perturbe le cycle cellulaire. Chez radA et oex1, les expériences d’incorporation d’EdU suggèrent un allongement de la phase G2. Les lignées CyTRAP associées aux mitoTALEN confirment cette altération, bien que les phases concernées restent à préciser. Des indices de mort cellulaire ont également été observés, suggérant l’implication de voies dépendantes de NAC.

2- Les analyses de dynamique mitochondriale montrent que l’instabilité du mtDNA réduit la motilité mitochondriale chez radA, principalement par augmentation d’une sous-population de mitochondries statiques. Ces résultats suggèrent un lien entre intégrité du génome mitochondrial, activité métabolique et organisation du réseau mitochondrial.

3- Les analyses transcriptomiques révèlent une réponse commune à radA et oex1, marquée par l’activation de la voie rétrograde dépendante de NAC017. En parallèle, les lignées mito-cTALEN inductibles montrent une activation plus forte des voies de réponse aux dommages de l’ADN et du facteur SOG1, suggérant que les réponses précoces aux cassures diffèrent des effets secondaires observés dans les mutants chroniques.

4- Les analyses épigénétiques n’ont pas mis en évidence de lien direct entre méthylome et changements transcriptionnels. En revanche, le séquençage du mtDNA après induction des mito-cTALEN montre une diminution globale du contenu mitochondrial, compatible avec une dégradation du génome après cassures non réparées.

5- L’étude des espèces réactives de l’oxygène (ROS) avec les lignées roGFP-Orp1 a été limitée par le silencing des constructions. Les résultats n’indiquent pas d’augmentation du signal H₂O₂ dans radA, mais suggèrent une adaptation redox impliquant le glutathion et les mécanismes antioxydants, remettant en question l’hypothèse d’un contrôle direct par accumulation globale de ROS.

6- Un crible génétique visant à identifier des suppresseurs du phénotype radA a été engagé mais limité par la faible fertilité des plantes. Au moins une mutation récessive suppressive a néanmoins été identifiée et est en cours de caractérisation.

Ce travail met en évidence que l’instabilité du génome mitochondrial déclenche des réponses rétrogrades complexes impliquant la régulation du cycle cellulaire, la dynamique mitochondriale, des programmes transcriptionnels spécifiques ainsi que des ajustements du métabolisme redox. Plusieurs questions restent néanmoins ouvertes.

Une première perspective consiste à préciser les mécanismes reliant les dommages au mtDNA au contrôle du cycle cellulaire. L’identification des phases affectées et des voies de signalisation impliquées permettra de déterminer si les réponses observées relèvent principalement de mécanismes de surveillance du génome, de contraintes métaboliques ou de signaux rétrogrades spécifiques. L’utilisation combinée des lignées CyTRAP et des systèmes mitoTALEN inductibles constitue un cadre particulièrement adapté pour dissocier les réponses précoces des effets secondaires chroniques.

Les résultats transcriptomiques suggèrent également une articulation entre les voies dépendantes de NAC017 et SOG1. Définir les relations fonctionnelles entre ces régulateurs constitue une étape importante afin de comprendre comment les cellules intègrent les signaux issus des dommages mitochondriaux avec les réponses nucléaires au stress. Des approches génétiques et temporelles permettront d’établir la hiérarchie et la dynamique de ces voies.

L’altération de la motilité mitochondriale observée chez radA ouvre aussi la question du lien entre intégrité du génome mitochondrial, activité bioénergétique et organisation du réseau mitochondrial. L’analyse conjointe de paramètres fonctionnels et structuraux pourrait permettre d’identifier les mécanismes coordonnant maintien du génome et dynamique des organites.

Les résultats obtenus avec les lignées roGFP-Orp1 invitent par ailleurs à reconsidérer le rôle des ROS comme signal primaire de la réponse rétrograde. Le développement de systèmes rapporteurs plus robustes et l’analyse ciblée des compartiments redox permettront d’évaluer le rôle du glutathion et des mécanismes antioxydants dans l’adaptation aux dommages mitochondriaux.

Enfin, l’identification préliminaire d’au moins un suppresseur récessif du phénotype radA constitue une perspective majeure. La caractérisation moléculaire de cette mutation pourrait révéler de nouveaux acteurs impliqués dans la perception des dommages au mtDNA, la signalisation rétrograde ou les mécanismes de tolérance permettant de maintenir l’homéostasie cellulaire malgré l’instabilité du génome mitochondrial.

Les plantes et leur capacité photosynthétique sont essentielles à la survie des animaux, tout comme les activités complémentaires de respiration qui ont lieu dans les mitochondries, qui affectent directement la productivité des cultures et l’adaptation aux changements environnementaux.
La recherche sur la biogenèse des organelles est donc d’une importance stratégique majeure. La fonction des mitochondries dépend du maintien et de l’expression de son génome, l’ADNmt, ainsi que de la coordination étroite avec le génome nucléaire qui est essentielle à l’homéostasie énergétique, la vigueur des plantes et la réponse aux stress. Tous les génomes sont exposés à des stress environnementaux et métaboliques qui compromettent leur intégrité, et les cellules ont développé des points de contrôle, pour coordonner la progression du cycle cellulaire avec la réparation de l’ADN. Bien que ces mécanismes soient bien connus pour l’ADN nucléaire, ils ont été peu étudiés dans le compartiment génétique mitochondrial. Il s’agit d’un manque de connaissances majeur, car les organites en tant que centrales énergétiques de la cellule génèrent de grandes quantités de molécules génotoxiques, telles que les espèces réactives de l’oxygène (ROS), et leurs génomes sont donc particulièrement susceptibles d’accumuler des lésions. Le projet «Mitochondrial DNA Damage Response» (MIT2DR) vise à combler cette lacune. Le projet MIT2DR est fondé sur des résultats obtenus conjointement par P1 et P2, montrant que des défauts de croissance de mutants déficients dans la maintenance de l'ADNmt étaient corrélés à l'induction d'inhibiteurs de la progression du cycle cellulaire, apparemment en réponse à un pic de ROS. P1 a également observé des phénotypes similaires dans des lignées exprimant des endonucléases TALEN mito-ciblées, qui ont déjà été confirmées par P1 comme étant très efficaces et donc idéales pour l'étude des réponses induites par les dommages à l'ADNmt. En exploitant l'édition ciblée de l'ADNmt par des nucléases TALEN et des mutants d'Arabidopsis déficients pour la réparation de l'ADNmt, le projet propose de disséquer les cascades de signalisation rétrogrades (mitochondrie vers le noyau) régulant la réponse cellulaire aux dommages de l'ADNmt, et ainsi de déchiffrer comment les atteintes à l'intégrité de l'ADNmt affectent le développement des plantes. Le projet combinera des approches génomiques, génétiques, biochimiques et cytologiques de pointe. En combinant des approches de transcriptomique et de profilage de l’épigénome, ce projet permettra de décrypter les changements d’expression des gènes induits en réponse aux lésions de l’ADNmt et les modifications de la chromatine sous-jacents. Les réponses précoces seront étudiées à l'aide de la modification de l'ADNmt par des exonucléases TALEN inductibles. En utilisant des lignées rapportrices exprimant des biocapteurs fluorescents nous examinerons la cascade de signalisation des dommages causés par l'ADNmt, en explorant la production et la détoxification de ROS dans les plantes TALEN et dans les mutants de réparation de l'ADNmt. Enfin, le projet MIT2DR identifiera de nouveaux éléments de signalisation grâce à une approche de crible génétique.
Le projet capitalise sur l'expertise complémentaire des deux partenaires: le partenaire P1 est un expert de l'expression génétique mitochondriale et un contributeur majeur dans le domaine de la recombinaison et de la réparation de l'ADNmt, tandis que le partenaire P2 a une vaste expertise dans l'analyse de la régulation et la progression du cycle cellulaire, à l'aide d'approches de cytologie et d'imagerie, et dans l'analyse de la méthylation de l'ADN et des modification de la chromatine par ChIP-seq.