Régulation de la formation du micropyle de l'ovocyte de poisson par le mircroARN 202 via la voie hippo – MicroHippo

Nous aurons recours à une analyse transcriptomique ancrée topologiquement afin de cibler la zone de la MPC et caractériser les dérégulations géniques induites par l’invalidation (KO) de miR-202 et identifier ainsi de nouveaux acteurs potentiels. Nous rechercherons dans cette zone les gènes prédits in silico comme étant des cibles potentielles de miR-202 et montrant une faible variation inter-individuelle de leur expression ce qui en ferait des cibles biologiques préférentielles. L’étape ultime du travail consistera à valider la pertinence biologique de ces cibles par édition de génome en supprimant le site de fixation de miR-202 dans la partie 3’UTR des ARNm cibles afin d’obtenir un phénotype équivalent à celui induit par le KO de miR-202.

L'identification des cibles biologiquement pertinentes des microARN reste un défi majeur, la liste des cibles putatives prédites in silico étant généralement bien trop longue pour permettre une validation fonctionnelle exhaustive. Afin de répondre à cette limitation, nous avons développé une stratégie de novo, c'est-à-dire sans a priori sur l'identité de la cible, permettant d'identifier des cibles phénotypiques de miR-202 à partir de données de RNA-seq, en utilisant le modèle médaka KO pour mir-202, chez lequel l'inactivation du gène induit un phénotype reproducteur marqué à l'échelle de l'organisme, notamment une réduction de la production d'œufs. En appliquant de nouveaux critères de sélection, à savoir une variation d'expression limitée chez les mutants KO et une faible variabilité interindividuelle de l'expression génique, nous avons pu réduire la liste initiale de 2853 cibles putatives à une liste restreinte de seulement 5 candidats. Parmi ceux-ci, tead3b, un membre de la voie Hippo hautement conservée au cours de l'évolution et connue pour réguler les fonctions ovariennes, a été sélectionné en raison de son affinité de fixation remarquablement forte et conservée pour miR-202-5p. La délétion du site de fixation de miR-202-5p dans la région 3'UTR de tead3b a entraîné une réduction de la production d'œufs, phénotype qui n'a en revanche pas été observé lors de la délétion du site de fixation dans les 3'UTR des deux autres membres de la voie Hippo testés, sav1 et vgll4b. Ces résultats constituent ainsi l'un des rares exemples réussis d'attribution fonctionnelle de novo d'une cible phénotypique de microARN in vivo chez les vertébrés.

Le travail va se poursuivre par l'identification des autres cibles fonctionnelles de miR-202, y compris celles régulant la fertilité mâle.

Chez les poissons, l’absence de miR-202 se traduit par une baisse marquée de la fécondabilité des ovocytes. Ce phénotype semble associé à un défaut de formation du micropyle (la structure qui guide le spermatozoïde vers l’ovocyte lors de la fécondation) qui provient de la différenciation de la cellule micropylaire (MPC, micropylar precursor cell), une cellule de la granulosa dont la différenciation est contrôlée par la voie Hippo. Des données préliminaires indiquent que le micropyle serait fermé à sa base et ne permettrait donc pas le passage du spermatozoïde et donc la fécondation. En outre, l’absence de miR-202 est associée à une dérégulation de l’expression de plusieurs membres de la voie Hippo, dont Taz, dont l’importance dans le contrôle de la différenciation de la MPC a été récemment décrite chez le poisson.
L’objectif du projet est donc de comprendre comment l’absence de miR-202 conduit à une différenciation anormale de la MPC dane le follicule ovarien (et donc à un micropyle non fonctionnel) via la modulation de la voie Hippo.
L’hypothèse de travail est que miR-202 module directement ou indirectement la voie Hippo ce qui conduit à une dérégulation de la différenciation de la MPC et à la formation d’un micropyle non fonctionnel.
Le projet sera organisé en 4 tâches largement chevauchantes. Après une analyse approfondie du phénotype « micropyle fermé » par microscopie électronique à balayage (MEB) et serial block face MEB, nous ambitionnons de caractériser finement la différenciation moléculaire de la MPC en l’absence de miR-202 via l’étude approfondie de l’expression de Taz, d’autres membres de la voie Hippo et de protéines impliquées dans la différenciation de la MPC. Pour cette tâche nous ferons appel à des analyses d’hybridation in situ et d’immunodétection en 3D. Nous aurons de plus recours à une analyse transcriptomique ancrée topologiquement afin de cibler la zone de la MPC et caractériser les dérégulations géniques induites par l’invalidation (KO) de miR-202 et identifier ainsi de nouveaux acteurs potentiels. Nous rechercherons dans cette zone les gènes prédits in silico comme étant des cibles potentielles de miR-202 et montrant une faible variation inter-individuelle de leur expression ce qui en ferait des cibles biologiques préférentielles. L’étape ultime du travail consistera à valider la pertinence biologique de ces cibles par édition de génome en supprimant le site de fixation de miR-202 dans la partie 3’UTR des ARNm cibles afin d’obtenir un phénotype équivalent à celui induit par le KO de miR-202. Globalement, ces résultats nous permettront de proposer un modèle de régulation de la formation de la cellule micropylaire par miR-202 via la modulation de la voie Hippo.
Le projet reposera sur l’expertise complémentaire de deux partenaires. Le laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons (LPGP/INRAE, Rennes ; partenaire 1 et coordinateur, responsable scientifique J Bobe) possédant une expertise sur l’ovogenèse, ayant réalisé de KO du gène mir-202 et décrit le phénotype associé qui sera en charge des expérimentations y compris l’édition de génome. L’équipe Impact Systémique de petit ARN régulateurs (IGH/CNRS, Montpellier ; partenaire 2, responsable scientifique H Seitz) possédant une expertise sur la régulation des processus biologiques par les miARN qui sera en charge des analyses bioinformatiques. Les deux partenaires uniront leurs forces pour interpréter les données et proposer un modèle de régulation de la formation de la cellule micropylaire par miR-202 via la régulation de la voie Hippo.
Le projet MicroHippo aura un impact dans trois domaines scientifiques qui sont (i) la régulation des processus biologiques par les miARN, (ii) le rôle de la voie Hippo dans le contrôle de la différenciation cellulaire, et (iii) la meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent la capacité d’un ovocyte à être fécondé.