Développement de chambres microfluidiques pour étudier l’axe Cœur-Cerveau dans les Torsades de Pointes – NeuroCard

Le projet ambitionne de construire un réseau biologique modélisant l’axe neuro-cardiaque in vitro pour explorer la communication entre les neurones autonomiques et les cardiomyocytes en situations physiologique et pathologique (LQT2 et TdP iatrogènes).

NEUROCARD vise à développer des dispositifs microfluidiques (µFCs) permettant d’établir des cocultures de cardiomyocytes (CMs) innervés par des motoneurones autonomiques (MNAs) (sympathiques et cholinergiques) dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs). Un tel dispositif est nécessaire pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique des nouveaux médicaments, en permettant leur application compartimentée ainsi que l’analyse moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des réponses (électrophysiologie et signalisation Ca2+ intracellulaire) de chaque type cellulaire. Ces co-cultures MNA-CM dans les µFCs seront évaluées comme un nouveau test de sécurité HERG et pour identifier de nouveaux biomarqueurs de torsadogénicité. Nous développerons des hiPSCs LQT2 pour étudier les propriétés intrinsèques des MNAs et CMs et apporter de nouvelles connaissances sur les altérations moléculaires et fonctionnelles des MNAs dérivés d'un patient LQT2 présentant à la fois des symptômes neurologiques et cardiaques. Finalement, nous explorerons la signature neuro-cardiaque dans le LQT2 en « mélangeant et appariant » des MNAs et CMs dérivés de hiPSCs (LQT2 versus sain) dans les µFCs pour caractériser les interactions moléculaires et fonctionnelles entre ces cellules dans le LQT2.

Dans le cadre de cette étude, trois types de dispositifs microfluidiques compartimentés ont été développés et optimisés : les puces MBBT appelées Brainies™, conçues pour les cocultures « classiques » de neurones et de cardiomyocytes ; les puces MBBT appelées Mindies™, spécifiquement conçues pour un couplage direct avec des réseaux de microélectrodes (MEA) ; et enfin, un troisième type de puce nommé 3C, intégrant un compartiment central destiné à des expériences complémentaires, permettant la section sélective des axones à l’aide de Triton, utilisé comme expérience contrôle. Chaque puce comprend deux chambres de culture , chacune reliée à deux réservoirs (l'un étant le compartiment neuronal et le second, le compartiment cardiaque), séparées par des microcanaux asymétriques pour empêcher le passage des cellules entre les compartiments.

Nous avons généré des cardiomyocytes ventriculaires ainsi que des motoneurones autonomes (sympathiques) à partir de lignées hiPSC saines et LQT2, et nous les avons caractérisés structurellement et fonctionnellement. Nous avons réussi à développer un organ-on-chip dans lequels les cardiomyocytes dérivés de hiPSC sont innervés par des motoneurones sympathiques. Les motoneurones sont capables de moduler le couplage excitation-contraction des cardiomyocytes via les neurotransmetteurs. Nous avons utilisé deux conditions de coculture des deux types cellulaires, dérivés soit de la même lignée hiPSC (saine ou mutée), que nous avons comparées, soit dans une condition « mixte » combinant neurones sains avec cardiomyocytes LQT2, et inversement.

Les résultats obtenus avec des cellules du même génotype indiquent qu’une fois les cardiomyocytes innervés par les neurones sympathiques, la fréquence de battement de la lignée saine augmente, tandis qu’avec le génotype LQT2, elle diminue significativement. Ceci suggère un remodelage profond de la jonction neurocardiaque dans le LQT2. Le temps de décroissance des transitoires calciques dans les cocultures LQT2 est fortement augmenté par rapport à la condition saine, conduisant à une incidence beaucoup plus élevée d’arythmies cellulaires. Fait intéressant, en présence de neurones sains, la proportion de cardiomyocytes LQT2 présentant des arythmies tend à diminuer.

Parallèlement, en utilisant des cellules saines (neurones innervant les cardiomyocytes) dans le dispositif microfluidique, nous avons testé l’efficacité de ce système pour détecter un risque iatrogène. Ce dispositif s’est montré très efficace pour identifier le potentiel arythmogène des composés à risque, sans faux négatifs, et pour détecter des composés à risque intermédiaire—capacité que le modèle de cardiomyocytes hiPSC isolés n’avait pas démontrée.

Maintenant que le dispositif microfluidique a été développé et la méthodologie optimisée et que les conditions de culture sont bien établies, les résultats obtenus pour notre lignée hiPSC LQT2 seront validés en utilisant la lignée isogénique corrigée spécifique. De plus, en intégrant à la fois les neurones parasympathiques et sympathiques, la nouvelle configuration de notre modèle offrira une plateforme plus prédictive pour évaluer la pathogenicité de variants géniques spécifiques et pour la détection précoce du risque torsadogène de nouvelles entités chimiques en R&D.

Les Torsades de Pointes (TdPs) sont des arythmies ventriculaires responsables de morts subites chez des patients sans anomalie structurale cardiaque. L’issue fatale des TdPs implique la nécessité de pouvoir identifier précocement les patients à risque. Ces patients présentent un allongement anormal de la repolarisation cardiaque ventriculaire, identifié comme syndrome du QT long (LQT). Nous avons montré que cette repolarisation anormale n’est pas suffisante pour déclencher les TdPs. En effet, les TdPs que ce soit dans les formes héréditaires ou les formes acquises de LQT (composés bloqueurs du canal ionique hERG), requièrent une altération de l’activité du système nerveux autonome.
L’excitabilité des cardiomyocytes (CMs) et des motoneurones ‘autonomes’ (MNAs) dépend des canaux ioniques, en particulier du canal potassique hERG. Des patients LQT2 (mutation HERG) présentent communément des comorbidités neurologiques (épilepsie), qualifiant le LQT2 de pathologie neuro-cardiaque. Cependant, peu d’études se sont intéressées au rôle des MNAs sur la fonction électrique des CMs. De même, les conséquences de la dépression du canal HERG neuronal sur la genèse des TdPs restent méconnues. Pour les LQT acquis, cela a un impact majeur sur l’efficacité de l’évaluation réglementaire de la sécurité des candidats-médicaments qui est actuellement effectuée exclusivement sur des CMs ou des lignées cellulaires exprimant le HERG, excluant l’effet des MNAs dans la torsadogénèse.
Les propriétés intrinsèques des MNAs et leur capacité de modulation des CMs sont peu connues essentiellement à cause de difficultés méthodologiques et techniques à modéliser les interactions neuro-cardiaques. C’est pourquoi, nous avons constitué le consortium NEUROCARD regroupant des experts en électrophysiologie, en signalisation Ca2+ intracellulaire, en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) en cardiologie et en neurosciences et une entreprise spécialisée dans le développement de dispositifs microfluidiques. NEUROCARD ambitionne de construire un réseau biologique modélisant l’axe neuro-cardiaque in vitro pour explorer la communication entre les MNAs et les CMs en situations physiologique et pathologique (LQT2 et TdP iatrogènes). NEUROCARD a pour objectifs (1) de développer des dispositifs microfluidiques (µFCs) permettant d’établir des cocultures de CMs innervés par des MNAs (sympathiques et cholinergiques) dérivés de hiPSCs. Un tel dispositif est nécessaire pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique des composés, en permettant leur application compartimentée ainsi que l’analyse moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des réponses (électrophysiologie et signalisation Ca2+ intracellulaire) de chaque type cellulaire. Ces co-cultures AMN-CM dans les µFCs seront évaluées comme un nouveau test de sécurité HERG et pour identifier de nouveaux biomarqueurs de torsadogénicité. (2) Nous développerons des hiPSCs LQT2 (patient vs contrôle isogénique corrigé) pour étudier les propriétés intrinsèques des MNAs et CMs et apporter de nouvelles connaissances sur les altérations moléculaires et fonctionnelles des MNAs dérivés d'un patient LQT2 présentant à la fois des symptômes neurologiques et cardiaques. Finalement (3), nous explorerons la signature neuro-cardiaque dans le LQT2 en « mélangeant et appariant » des MNAs et CMs dérivés de hiPSCs (LQT2 versus isogénique corrigé) dans les µFCs pour caractériser les interactions moléculaires et fonctionnelles entre ces cellules dans le LQT2.
Les développements technologiques (µFCs, LQT2 hiPSCs) issus de ce projet offrent une opportunité unique de déchiffrer les dysfonctions neuro-cardiaques à l’origine des TdPs et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques/traitements dans le LQT2. Ce projet permettra également de tester l’efficacité et la sécurité de nouveaux composés vers une meilleure prévention et efficacité de traitement des pathologies cardiaques.