Cibler l'activité exogène du NaV1.1 à des neurones inhibiteurs chez les souris atteintes du syndrome de Dravet – DSynchro

Neuroanatomie et histologie: Les souris C57BL/6N-Scn1a/Ics ont été tuées à des points de temps définis et leur cerveau, leur sang et leurs cœurs ont été dépistés pour la présence de

Biologie moléculaire, virologie et culture cellulaire: nous avons utilisé notre expertise pour générer des vecteurs CAV-2 où l'expression transgénique est contrôlée par des combinaisons d'amplificateurs promoteurs à tester chez des souris atteintes du syndrome de Dravet.

Injections de transfert de gènes/stéréotaxiques: la thérapie génique pour les maladies du cerveau est souvent difficile parce que le moyen le plus efficace de cibler certaines populations neuronales est par injections stéréotaxiques. L'éconsortium maîtrise ces techniques.

Électrophysiologie: l'hyperexcitabilité du réseau est mieux mesurée par électrophysiologie in vivo et/ou ex vivo. Nos collègues de Tel Aviv et de Philadelphie ont effectué ces essais.

Comportement et cognition: Les souris C57BL/6N-Scn1a/Ics ont été testées pour des signes du syndrome de Dravet en raison de la possibilité que la fusion mCitrine-NaV1.1 puisse avoir été dysfonctionnelle. Nous avons testé la nidification, l'électrophysiologie, la prise de poids, l'anxiété et les équilibres liés au sexe pendant la reproduction.

Biochimie: Pour déterminer si la protéine de fusion mCitrine-NaV1.1 était stable, nous avons utilisé l'immunoblot pour les extraits du cerveau.

*Génération et caractérisation de souris C57BL/6N-Scn1a/Ics

Les souris C57BL/6N-Scn1a/Ics ont été créées avec l'aide généreuse de la Clinique de la souris à Strasbourg.

A) Les souris sont indiscernables des termes ;

B) Aucun signe d'activité épileptique à partir d'analyses EEG ;

C) Prise de poids normale pour les souris mâles et femelles ;

D) Comportement de nidification identique aux contrôles ;

E) Sexe et génotype suivent les modèles mendéliens classiques.

Les protéines totales et membranaires ont été dosées par immunoblotting pour l'immunoréactivité mCitrine, montrant une bande à >200 kDa cohérente avec la protéine de fusion mCitrine-Nav1.1.

Ces données sont cohérentes avec une balise fonctionnelle sur le NaV1.1.

Nous avons utilisé ces souris pour mieux caractériser la localisation subcellulaire et cellulaire de NaV1.1. Ces données nous ont permis de cibler la thérapie vers diverses populations de neurones et soutiennent davantage notre stratégie thérapeutique.

Travaillez l'imagerie fluorescente en cours en direct des neurones de souris C57BL/6N-Scn1a/Ics. Voir ci-dessous pour plus de détails.

* Cibler uniquement les neurones inhibiteurs dans l'hippocampe de souris atteintes de DS

Développement de vecteurs

Nous avons développé CAV-DLX2.0-SCN1A, un vecteur qui contenait une combinaison promoteur/amplificateur synthétique (DLX2.0) qui conduit à une expression préférentielle dans les neurones inhibiteurs au site d'injection/près du site d'injection. La bio-distribution de l'expression transgénique a également été contrôlée par CAV-DLX2.0-mCitrine.

Nous avons également développé CAV-E2-SCN1A, un vecteur qui contenait un amplificateur en amont de Scn1a qui conduit à une expression préférentielle dans les neurones PV au site d'injection/près de l'injection. La bio-distribution de l'expression transgénique a également été contrôlée par CAV-E2-mCitrine.

Efficacité in vivo

Nous avons constaté que si le CAV-DLX2.0-SCN1A et le CAV-E2-SCN1A réduisaient la mort inattendue soudaine (SUDEP) chez les souris atteintes de DS, cela n'avait aucun effet significatif sur les crises d'induction thermique. Ces données soutiennent encore notre stratégie thérapeutique et suggèrent que l'activité exogène du NaV1.1 est nécessaire dans les neurones excitateurs et inhibiteurs pour une efficacité maximale.

Des études antérieures ont suggéré - sur la base de l'IHC avec des anticorps anti-NaV1,1 - un emplacement préférentiellement dans le segment initial axon de neurones inhibiteurs, tandis que nos analyses IHC et IF de . Nos analyses IHC et IF ne soutiennent pas ces résultats car nous voyons l'expression dans tout le cerveau dans les axones et les dendrites.

Caractérisation in vitro des neurones C57BL/6N-Scn1a/Ics souris

L'un de nos objectifs futurs est de mieux comprendre le trafic de NaV1,1, afin de permettre une localisation sous-cellulaire plus définie dans les neurones inhibiteurs par rapport aux neurones excitateurs. Notre plan est de générer 1° de cultures neuronales à partir de cerveaux adultes et d'utiliser l'imagerie fluorescente à molécule unique pour suivre mCitrine-NaV1.1.

Le syndrome de Dravet (SD) est une épilepsie infantile sévère causée par une haplo-insuffisance du gène SCN1A. SCN1A code pour NaV1.1, la sous-unité alpha d'un canal sodique voltage-dépendant de type I. Une diminution importante de l'activité de NaV1.1 génère un déséquilibre entre excitation et linhibition cérébrales et entraîne des comorbidités liées au SD. Le manque d'efficacité des médicaments antiépileptiques conventionnels (pharmacologiques) et l'impact potentiel sur le patient et sa famille pendant des décennies représentent un lourd fardeau financier et émotionnel. Il est important de noter que 73 % des enfants atteints de SD meurent avant leur 10e anniversaire. Des thérapies alternatives sont donc nécessaires.

En raison de l'haplo-insuffisance, les approches étiologiques telles que la thérapie génique pourraient améliorer considérablement la vie des enfants atteints de SD. Les éléments stratégiques du transfert de gènes en clinique sont la perfection de la conception, de l'efficacité, de l’administration et de la cinétique d'expression des vecteurs. Les plus grands défis qui dominent la thérapie des maladies neurodéveloppementale sont 1) le ciblage de la bonne population de cellules (neurones, astrocytes et/ou microglie) dans la ou les structures souhaitées, 2) la réparation des neurones endommagés ou détériorés, 3) le maintien en vie des cellules saines et/ou corrigées dans des environnements potentiellement toxiques, 4) la modification d'un nombre suffisant de cellules pour avoir un impact clinique, 5) le maintien de niveaux d'expression thérapeutiques pendant des décennies, et/ou 6) la dotation du cerveau de capacités d'autoréparation.

Depuis trois ans, nous développons une approche de remplacement de gènes pour le SD.
Bien que ne modifiant pas le principal déficit en neurones inhibiteurs, nous avons déjà démontré un impact significatif sur la réduction des crises et l'augmentation de la durée de vie. DSynchro aborde les aspects fondamentaux et translationnels de la thérapie du SD en modifiant la conception des vecteurs pour cibler l'expression de SCN1A dans les neurones inhibiteurs, tester les effets thérapeutiques et comprendre les changements de synchronisation induits par l'activité exogène de NaV1.1.

Notre consortium, qui comprend une expertise dans le développement de vecteurs, le transfert de gènes dans le cerveau, l'électrophysiologie, la physiopathologie du SD et la thérapie clinique, est parfaitement adapté pour développer une thérapie innovante pour le SD.