Approches de génétique moléculaire et fonctionnelle pour déchiffrer les mécanismes physiopathologiques de l'albinisme oculocutané. – OCAGEN

L'albinisme est une maladie rare associant hypopigmentation et déficience visuelle grave. Les liens entre altération de la pigmentation et anomalies du développement de la rétine conduisant au déficit visuel demeurent incompris. L’albinisme est cliniquement et génétiquement hétérogène avec 21 gènes connus dont l’analyse des régions codantes permet d’atteindre environ 70% de diagnostic. Chez les 30% restant les variants peuvent se situer dans les régions non codantes des gènes ou dans de nouveaux gènes à identifier. Nombre de variants demeurent de signification inconnue (VUS), ce qui empêche également d’établir le diagnostic. Le premier objectif du projet est d’améliorer le diagnostic par recherche de variants dans les éléments régulateurs des gènes et par caractérisation fonctionnelle des VUS. Le second objectif est d’établir les liens moléculaires entre anomalies génétiques, voies fonctionnelles et altérations rétiniennes. Le projet se concentrera sur 5 types d'albinisme oculocutané et les gènes correspondants: OCA1 (TYR), 2 (OCA2), 3 (TYRP1), 4 (SLC45A2) et 8 (TYRP2/DCT).
Les éléments régulateurs des 5 gènes demeurent mal connus. Nous les caractériserons par l’approche expérimentale de promoteur capture Hi-C qui complétera une approche bioinformatique déjà réalisée au laboratoire. Des variants pathogènes seront recherchés dans les éléments régulateurs ainsi identifiés par séquençage du génome de patients porteurs de variants hétérozygotes des 5 gènes cibles et seront validés par des études fonctionnelles.
Le décryptage des VUS constitue un enjeu majeur pour le diagnostic. Nous mettrons au point un test fonctionnel rapide basé sur le sauvetage de la pigmentation dans des lignées de cellules mélanocytaires MNT-1. Les 5 gènes seront inactivés par CRISPR-Cas9 afin de produire des lignées indépendantes pouvant être transfectées avec les ADNc porteurs des VUS à tester. Le caractère pathogène des VUS sera établi par comparaison avec des variants pathogènes et bénins connus. Outre le phénotype simple de pigmentation et le dosage de mélanine, des études complémentaires de trafficking intracellulaire et de mesure du pH des mélanosomes, par exemple, seront réalisées en particulier pour les VUS conférant un phénotype intermédiaire. Les lignées invalidées seront également exploitées pour répondre à des questions de biologie fondamentale. Ainsi, les analyses qualitatives et quantitatives des différents intermédiaires métaboliques des mélanines (dont la L-DOPA) permettront de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées et la physiopathologie de la maladie.
L’approche d’invalidation de différents gènes sera également utilisée pour générer des cellules iPS isogéniques que nous différencierons en cellules de l’épithélium rétinien pigmenté (EPR). Ceci nous permettra d’investiguer pour la première fois l’impact de l’invalidation des gènes OCA sur la morphologie et fonctionnalité de l’EPR humain. En parallèle les iPSC seront différenciées en organoïdes rétiniens qui permettront d’investiguer l’impact de l’EPR déficient sur le développement rétinien et de mieux comprendre la genèse des anomalies visuelles chez les patients. Les lignées d’EPR dérivées d’iPSC permettront aussi de caractériser des éléments régulateurs spécifiques de l’EPR parmi ceux que nous aurons identifiés, et de tester fonctionnellement des VUS en complément des études réalisées dans les MNT-1.
Ce projet à visée translationnelle sera réalisé par deux partenaires ayant des expertises complémentaires (Partenaire 1: cohorte de patients, génomique, biochimie, biologie cellulaire, développement de l’œil, essais fonctionnels en culture et en modèles animaux; Partenaire 2: iPSC, RPE, organoïdes, pathologies de la rétine, essais fonctionnels sur modèles dérivés d'iPSC) et aura des retombées directes sur l’amélioration du diagnostic, sur la compréhension des mécanismes conduisant aux anomalies oculaires de l’albinisme, et à plus long terme sur des perspectives thérapeutiques.