Exploration de la maturation in vitro du tissu testiculaire prépubère frais ou décongelé par approche « single cell » – sc-SpermInVitro

La congélation du tissu testiculaire (CTF) est proposée pour préserver la fertilité des garçons prépubères avant un traitement du cancer hautement gonadotoxique. La spermatogenèse in vitro est l'une des approches potentielles qui pourrait être utilisée pour restaurer la fertilité masculine après la guérison. En raison de la rareté du tissu testiculaire prépubertaire humain disponible pour la recherche, la recherche en amont doit être réalisée dans des modèles animaux. Une spermatogenèse complete a été réalisée in vitro avec succès dans le modèle de la souris. Cependant, le rendement de la spermatogène in vitro dans ce modèle reste faible et le processus de congélation-décongélation induit des effets néfastes additionnels pouvant entraver la capacité des cellules souches spermatogoniales (CSS) à se différencier in vitro. Selon les données préliminaires obtenues dans notre modèle de spermatogenèse in vitro chez la souris prépubère et afin d'améliorer le rendement de celle-ci, les objectifs de notre projet seront les suivants : (i) favoriser l'auto-renouvellement et la prolifération des CSS avant leur différenciation et étudier leur capacité à se différencier in vitro, (ii) explorer les voies de synthèse et de signalisation des androgènes/œstrogènes et identifier les dérégulations potentielles observées au cours de la spermatogenèse in vitro par comparaison aux conditions physiologiques, (iii) analyser la qualité nucléaire des spermatozoïdes obtenus in vitro, à partir du tissu testiculaire prepubère frais et congelé de souris, certaines modifications épigénétiques des embryons précoces et la santé de la descendance, (iv) évaluer les meilleures conditions de culture pour la maturation in vitro du tissu testiculaire prépubère humain et explorer l'identité et la fonctionnalité du pool de CSS humaines. Il s'agit de la première étude qui examinera au niveau de la cellule unique les voies paracrines et endocrines du testicule en développement in vitro afin de promouvoir la spermatogenèse in vitro. L'originalité de notre projet est également de reproduire la séquence complète qui pourrait être proposée aux garçons prépubères qui bénéficient d'une préservation de leur fertilité avant traitement du cancer hautement gondotoxique. Notre séquence comprendra : (i) la CTF du tissue testiculaire pépubère, (ii) la maturation in vitro du tissu testiculaire frais et congelé, (iii) l'analyse du génome et de l'épigénome des spermatozoïdes générés in vitro, (iv) l'analyse du développement et de la méthylation de l'ADN des embryons obtenus par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) et (v) l'évaluation de la santé de la descendance. En effet, nous pensons que l’optimisation des conditions de culture avec l'amélioration du milieu de culture ainsi que de l'apport en oxygène et en nutriments contribuera grandement à la promotion de la production in vitro de spermatozoïdes non seulement dans le modèle murin mais aussi dans le contexte d'une application humaine. En effet, nous évaluerons dans la deuxième partie du projet la possibilité de réaliser une spermatogenèse in vitro jusqu'au stade de cellules germinales haploïde dans des cultures de tissus testiculaires prépubères humains congelés et décongelés. Même si la stratégie n'aboutit pas aux résultats escomptés en termes d'amélioration du rendement de la spermatogenèse in vitro, cette étude pourrait conduire à l'identification d'autres facteurs dérégulés pendant la spermatogenèse in vitro chez la souris et l'homme et à d'autres modifications potentielles des conditions de culture. En outre, notre projet permettra d'obtenir de nouvelles données non seulement sur l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes de souris générés in vitro, dont on sait qu'elle est d'une importance cruciale pour la transmission équilibrée de l'information génétique aux générations futures, mais aussi sur la qualité de la descendance obtenue après ICSI en utilisant ces spermatozoïdes.