Régulation des enhancers par la méthylation de l'ADN chez les mammifères – REMEDY

Comme indiqué dans notre projet initial, nous avons concentré nos efforts sur un système modèle, celui des cellules ES de souris (mES). Il possède de nombreux avantages, dont la possibilité de modifications génétiques aisées par CRISPR ou d'autres méthodes, la possibilité d'effectuer des expériences de différenciation en conditions bien contrôlées. Nous avons étudié l'expression des gènes, la présence de marques chromatiniennes, et l'état de la chromatine par des approches de génomique (RNA-seq; Cut&Tag ATAC-seq). Les données ainsi générées forment un ensemble important que nous avons exploité par des analyses bioinformatiques complexes. Ces approches ont été complémentées par des expériences de biologie cellulaire (vidéomicroscopie, immunofluorescence, etc).

Grâce au soutien apporté par l'ANR et aux personnes recrutées pour ce projet, nous avons publié 3 articles de haut niveau (Gupta et al, Nature Structural and Molecular Biology 2023; Yakhou Nucleic Acids Research 2023; Monteagudo-Sanchez et al NAR 2024), ainsi que 3 articles de revue (Yamaguchi et al, Cancers 2022; Richard Albert & Greenberg Development 2023; Monteagudo-Sanchez NSMB 2024). De plus, deux autres articles importants sont en voie d'achèvement.

Les conclusions principales de ces deux articles en cours sont:

1) Azogui et al, in prep. Nous avons identifié une nouvelle protéine qui lie l'ADN méthylé aux séquences péricentromérique de souris, ZBTB38, et dont le rôle est conservé dans de multiples espèces de vertébrés.

2) Morales-Franco et al, in prep.

Les éléments cis-régulateurs, tels que les enhancers, jouent un rôle essentiel dans la coordination des programmes d’expression génique lors des transitions cellulaires. À ce titre, des efforts considérables ont été consacrés à la caractérisation des enhancers, notamment en ce qui concerne l’accessibilité de la chromatine, les sites de liaison des facteurs de transcription (TF), les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones et la méthylation de l’ADN en 5-cytosine (5mC). Des niveaux élevés de 5mC sont généralement corrélés à un état inactif des enhancers. Toutefois, il demeure difficile de déterminer si la 5mC empêche la liaison des TF ou si elle constitue simplement une conséquence en aval de la désactivation des enhancers. Les approches de génomique en population masquent en grande partie l’hétérogénéité cellulaire, tandis que les méthodes à cellule unique souffrent souvent d’un nombre limité de lectures par cellule.

Dans cette étude, nous avons exploité des technologies basées sur la tagmentation pour analyser simultanément les caractéristiques de la chromatine et la 5mC : Methyl-ATAC et Methyl-CUT&Tag* De plus, nous avons adapté cette approche afin d’examiner la dynamique de la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) (hM-ATAC). Nous avons appliqué ces techniques lors de la sortie de la pluripotence naïve dans les cellules souches embryonnaires (ESC) murines, un processus qui récapitule le programme embryonnaire d’établissement de la méthylation de l’ADN. L’un des avantages de ce système est qu’il tolère l’absence complète des machineries de méthylation et de déméthylation de l’ADN.

Grâce à l’économie de ces techniques, nous avons pu obtenir des informations robustes et dynamiques, à l’échelle de la molécule unique, sur la 5mC et la 5hmC au cours de cette transition cellulaire, couvrant à la fois l’accessibilité de la chromatine et un ensemble de

Nous avons également diffusé ces résultats dans notre communauté scientifique par le biais de participation à des congrès, ainsi que par l'organisation de deux congrès internationaux (Munich-Paris Epigenetics Meeting, Munich 2023; Paris-Munich Epigenetics Meeting, Paris 2025).

De nombreuses perspectives sont ouvertes par les résultats que nous avons obtenus. Nos analyses sur la méthylation de l'ADN et ses effecteurs à des phases critiques de la différenciation permet de mettre en évidence des acteurs moléculaires qui pourraient sous-tendre différentes maladies dont des cancers. Les approches moléculaires que nous avons développées seront utiles à de nombreuses équipes dans différents contextes de recherche. Enfin, nous avons initié une nouvelle série de rencontres scientifiques entre les communautés scientifiques de Paris et de Munich travaillant dans le domaine de l'épigénétique. Les deux premiers événements (2023, 2025), ont rencontré un grand succès. Un troisième événement est en préparation pour 2027, et nous espérons une continuation à long terme de ces rencontres.

La fonction des cellules dépend de leur profil d'expression génique, et son altération sont liées à de nombreuses maladies humaines. Ce profil est déterminé par les interactions entre régulateurs transcriptionnels, éléments régulateurs (promoteurs et enhancers), et paysage épigénétique de la cellule. Les 3 principales marques épigénétiques sont l'accessibilité de la chromatine, les modifications d'histones et la méthylation de l'ADN. Malgré les données existantes, une question importante non résolue est le rôle de la méthylation de l'ADN dans l'activité des enhancers de mammifères. La méthylation de l'ADN réprime-t-elle directement certains enhancers? En active-t-elle certains autres? Par quels mécanismes? Pour y répondre, nous utiliserons biologie moléculaire et génomique, dans un système cellulaire où la méthylation est dynamique et des outils génétiques disponibles. Nous développerons également une nouvelle technique sur molécule unique pour dépasser les analyses corrélatives.