Conjugaison site-spécifique pour accéder à des biomolécules homogènes - application aux vaccins glycoconjugués auto-adjuvantés – SiSHo
Biotechnologie pour des vaccins complètement définis et une efficacité optimale
Glycoconjugués homogènes Les vaccins contre les pneumocoques, classés dans la sous-famille des vaccins glycoconjugués, font partie des vaccins les plus efficaces et les mieux tolérés à ce jour. Satisfaire aux exigences des agences de médicament et de la population en améliorant la traçabilité du vaccin tout en optimisant la protection chez les personnes les plus susceptibles doit conduire à des vaccins de nouvelle génération et forme le défi que se propose de relever le projet SiSHo.
Conception, préparation et évaluation de vaccins glycoconjugués moléculairement définis auto-adjuvantés
Les sucres exprimés à la surface par les agents pathogènes sont reconnus comme étrangers par notre système immunitaire et il est connu depuis plus d'un siècle qu'ils peuvent être la cible d’anticorps protecteurs. Les vaccins glycoconjugués sont formés par des polysaccharides recouvrant la surface de bactéries pathogènes ou de mimes synthétiques de ces sucres liés de manière covalente à une protéine, appelée protéine porteuse. Le rôle de cette dernière est de permettre le recrutement d'une catégorie de globules blancs : les lymphocytes T auxiliaires. Ces lymphocytes sont à l'origine de la mise en place d’une réponse mémoire telle que recherchée dans le cadre de la vaccination. A noter que cette réponse mémoire n’est pas atteignable si les sucres sont administrés directement chez l’hôte c'est-à-dire en absence de protéine porteuse. La génération actuelle de vaccins glycoconjugués (contre le méningocoque et contre le pneumocoque) est basée sur des méthodes de liaisons empiriques du sucre à la protéine porteuse. Cette approche, pas toujours reproductible, conduit à des mélanges de glycoconjugués dont ni la composition exacte, ni l’immunogénicité ne sont totalement maîtrisées. Les progrès en synthèse organique et en immunologie (étude de l’antigénicité) nous permettent aujourd’hui de maîtriser la composante sucre des vaccins glycoconjugués. En revanche, des efforts doivent être fournis pour ce qui concerne la protéine porteuse, composante essentielle mais négligée de ces vaccins. Le projet SiSHo avait pour premier objectif de modifier de manière ciblée la(les) protéine(s) porteuse(s) de sorte à contrôler le processus de conjugaison. L’enjeu étant d’obtenir des glycoconjugués totalement ou hautement homogènes (idéalement un produit unique), facilement caractérisables du point de vue de leurs propriétés physico-chimiques et immunologiques. Le second objectif visait à apporter un effet supplémentaire à celui induit par le recrutement des seuls lymphocytes T-auxiliaires grâce à une adjuvantation choisie. Deux stratégies ont été envisagées avec pour objectif de lier les immunités adaptatives (réponse immunitaire évoluée dirigée spécifiquement contre un agent pathogène telle que celle produite par les lymphocytes T auxiliaires) et innées (réponse immunitaire aspécifique en réponse à tout agent exogène) : en premier lieu, grâce à l’utilisation d’une protéine de flagelle (organite responsable de la motilité de nombre de bactéries pathogènes) en tant que protéine porteuse, unique quant à sa capacité à se lier à un récepteur capable d'activer la réponse immunitaire innée. En second lieu, grâce au ciblage des lymphocytes T innés, répartis sur l’ensemble des muqueuses constituant la porte d’entrée de bactéries pathogènes. Ces deux stratégies ne sont rendues possibles que si la synthèse des glycoconjugués est totalement maîtrisée, comme envisagé dans le cadre du premier objectif.
Deux protéines porteuses ont été sélectionnées : l'une, appelée FliC est une protéine du flagelle de Salmonelle, un organite qui permet à la bactérie de se déplacer. FliC est capable de se lier et d’activer un récepteur de la réponse immunitaire innée (TLR5 ou Toll-Like Receptor 5); la seconde, PsaA (pour pneumococcal surface antigen A), est une protéine exprimée par l’ensemble des sérogroupes pathogènes de pneumocoques, impliquée en tant que facteur de colonisation des voies respiratoires supérieures de l’hôte.
Les protéines sont constituées d'un enchaînement d'acides aminés sélectionnés parmi 20 acides aminés appelés acides aminés canoniques. Les approches retenues consistent à appliquer des techniques de biologie moléculaire afin de remplacer de manière ciblée certains résidus des protéines FliC et de PsaA par un résidu cystéine ou un acide aminé non canonique.
La cystéine fait partie des acides aminés canoniques mais est absent des séquences de FliC et de PsaA. Introduire artificiellement des résidus cystéines (par une technique dite de mutagenèse), permet de bénéficier de la réactivité forte et spécifique de ces résidus comparées aux autres acides aminés canoniques pour pouvoir réaliser le greffage des sucres par un processus entièrement contrôlé.
L’introduction d'acides aminés non canoniques porteurs de fonctions biorthogonales (c’est-à-dire pouvant réagir spécifiquement par rapport à l’ensemble des acides aminés canoniques y compris la cystéine) permet également d'étendre la réactivité de ces protéines.
1- En procédant pas à pas, nous avons pu incorporer plusieurs résidus cystéines sur la protéine FliC. La protéine FliC est constituée de 4 domaines (D0-D3). Les domaines D0 et D1 sont responsables de liaison au TLR5. Les mutations ont donc été ciblées sur les seuls domaines D2 et D3. Cette stratégie a permis de préserver les capacités adjuvantes de FliC, y compris après conjugaison avec un tétrasaccharide modèle d'intérêt vaccinal alors que des conjugués obtenus par couplage aléatoire tel que pratiqué pour les conjugués de génération actuelle conduit à la perte de reconnaissance de FliC par le TLR5.
De tels composés dérivés de FliC, homogènes et conservant leur propriétés adjuvantes, n'avaient jamais été décrits précédemment.
2- Parallèlement, des résidus cystéines et différents acides aminés non naturels ont été introduits sur PsaA conduisant à des glycoconjugués homogènes.
3- Les conjugués qui ont été préparés dans le cadre de ce projet sont en cours d'évaluation dans un modèle souris. Pour cela, les souris sont immunisées avec les glyconjugués préparés en comparaison avec les vaccins commerciaux et des formulations équivalentes mais ne permettant l'activation des lymphocytes innés.
Les résultats préliminaires indiquent une réponse immunitaire forte dépendante de l'activation des voies ciblées.
Il s'agit d'abord de compléter les résultats biologiques :
Déterminer la qualité de la réponse immunitaire induite par nos glycoconjugués homogènes en référence au vaccin commercial.
Evaluer la contribution des lymphocytes à la réponse immunitaire observée par comparaison avec celle induite par les formulations contrôles de propriétés adjuvantes.
Valider l'effet protecteur de nos candidats vaccins contre les infections à pneumocoques
Les technologies développées dans le cadre de ce projet permettront d'envisager le développement de nouvelles constructions encore plus "intelligentes", arborant des éléments supplémentaires.
Les bioconjugués se réfèrent à des biomolécules - protéines, acides nucléiques ou sucres - liées de manière covalente entre elles ou à des médicaments, sondes fluorescentes, polymères de polyéthylène glycol… Les bioconjugués occupent une place de plus en plus importante dans les domaines des matériaux, des biotechnologies, des nanotechnologies et de la médecine. Parmi eux, les vaccins glycoconjugués formés d’antigènes polysaccharidiques liés à une protéine dite porteuse offrent une protection contre de nombreuses infections bactériennes. Cependant, le process de préparation des vaccins glycoconjugués reste très largement empirique et conduit à des mélanges de conjugués peu reproductibles de lot à lot, difficilement caractérisable et dont on ne maîtrise pas complètement l’immunogénicité. De plus, ces vaccins ne permettent que le recrutement d’une population restreinte de cellules immunitaires. Le présent projet allie la puissance de la synthèse organique pour préparer des antigènes oligosaccharidiques synthétiques mimes des polysaccharides habituellement utilisés et des molécules adjuvantes, l’ingénierie cellulaire pour obtenir des protéines porteuses, décorées de façon ciblée de fonctions bioorthogonales par la combinaison de techniques de mutagenèse ou d’incorporation d’acides aminés non naturels et la mise en œuvre de réactions de bioconjugaison efficaces pour permettre l’assemblage des différents partenaires afin d’obtenir pour la première fois des vaccins glycoconjugués auto-adjuvantés totalement homogènes. L’immunogénicité de ces glycoconjugués moléculaires sera évaluée in vitro et in vivo chez la souris dans un modèle d’infection aux pneumocoques.
Coordination du projet
Unité de fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (Organisme de recherche)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenariat
UFIP Unité de fonctionnalité et Ingénierie des Protéines
CEPR Centre d'Etude des Pathologies Respiratoires
CIIL UMR 9017 / U 1019 - CIIL - Centre d'infection et d'immunité de Lille
Aide de l'ANR 445 083 euros
Début et durée du projet scientifique :
novembre 2021
- 42 Mois
