Pin1-PROTACs: Dégradation versus Inhibition, GEneration d'outils pour la thérapie anticancéreuse – PRODIGE

La conception et la prédiction de la structure d’un PROTAC efficace peuvent s’avérer complexes. L’activité et la sélectivité d’un PROTAC ne dépendent pas uniquement de l’affinité du ligand pour la protéine d’intérêt (POI), mais également de plusieurs autres facteurs : 1) le choix du site de liaison sur la POI ; 2) le type de ligase recrutée ; 3) la nature de la combinaison des ligands POI-ligase E3 ; 4) la longueur et la composition du linker ; 5) la géométrie de l’ensemble du construct. La formation du complexe ternaire est essentielle pour obtenir un dégradeur efficace, et elle dépend de l’ensemble de ces paramètres. C’est pourquoi une approche combinatoire a été adoptée afin d’explorer un maximum de combinaisons et d’augmenter les chances d’obtenir des Pin1-PROTACs actifs.

Pour créer une série de PROTACs, différents ligands de Pin1 portant une alkyne terminale ont été envisagés. En parallèle, la synthèse de divers ligands de ligase E3 dotés d’un acide carboxylique terminal a été effectuée. Un assortiment de linkers azide / amine a également été conçu. L’assemblage des trois unités était faite via une cycloaddition CuAAC suivie d’une formation de liaison amide, afin d’obtenir toutes les combinaisons possibles.

Les affinités des ligands envers Pin1 ont était évaluée par RMN. Les 12 PROTACs synthétisés ont fait l’objet d’une évaluation biologique préliminaire actuellement en cours (tests de cytotoxicité, mesures de prolifération et de viabilité cellulaires, dosage de la dégradation de Pin1).

En 2020, nous avons également envisagé la création d’une seconde série de PROTACs avec deux objectifs : 1) réaliser la synthèse "in-cells" des PROTACs ; 2) augmenter les chances d’obtenir des PROTACs actifs en modifiant la réaction de « click » et donc la géométrie du dégradeur. L’auto-assemblage "in-cells" des PROTACs pourrait permettre de surmonter certaines limitations connues de cette stratégie thérapeutique. En effet, les PROTACs présentent généralement un poids moléculaire élevé et une surface polaire importante, ce qui peut limiter leur perméabilité cellulaire, leur solubilité, et compromettre leur biodisponibilité. En revanche, les deux précurseurs plus petits des PROTACs sont supposés être davantage perméables aux cellules.

Pour atteindre ces deux objectifs, nous avons prévu d’exploiter la cycloaddition IEDDA (Diels-Alder à demande électronique inverse) entre des ligands de Pin1 porteurs d’un trans-cyclooctène (TCO) et des ligands E3 marqués avec une tétrazine.

Actuellement, nous poursuivons encore l’évaluation de l’activité de dégradation de la 1ere série de Pin1-PROTACs ; l’approche in-cellulaire n’a donc pas encore été mise en œuvre et sera développée prochainement.

1) Synthèse et évaluation des ligands de Pin1

Pour synthétiser la première série de Pin1-PROTACs, nous avons développé differents ligands pseudopeptidiques de Pin1, perméables and "clickable" (DOI : 10.1039/d4cc05968a). L’affinité de liaison (KD) des ligands a été déterminée par RMN, selon la méthode de perturbation du déplacement chimique (CSP). Le composé 4a a montré la plus forte affinité, ce qui a permis d’identifier sa version protégée par un groupe SATE, le composé 4b, comme molécule leader pour les études biologiques et la synthèse des PROTACs.

Pour évaluer la perméabilité cellulaire du 4b, un analogue fluorescent (4b-Rhod) a été synthétisé. Sa perméabilité a été confirmée dans deux lignées de cancer de l’ovaire exprimant Pin1, SKOV3 et IGROV1. L’effet du composé 4b sur les cellules cancéreuses (MM1.R) a été évalué à l’aide d’un test de viabilité cellulaire MTT. Le 4b a induit une réduction de la prolifération cellulaire dépendante de la concentration, avec une IC₅₀ de 79 ± 13 μM. Pour confirmer la nécessité du groupe SATE pour la perméabilité, des cellules MM1.R ont été incubées avec les analogues non protégés 4a et 4c. Aucun de ces composés n’a affecté la viabilité cellulaire, suggérant que la protection SATE est indispensable à la pénétration cellulaire.

Un test enzymatique a été réalisé pour évaluer l’activité inhibitrice des composés 4a et 4b. Le 4a a montré une inhibition de Pin1, tandis que le 4b n’a pas présenté d’activité inhibitrice, vraisemblablement en raison de la protection SATE empêchant l’interaction avec Pin1.

2) Synthèse et évaluation des Pin1-PROTACs

À partir du composé 4b, 12 Pin1-PROTACs ont été synthétisés en variant la longueur et la composition du linker. La stabilité de ces composés a été évaluée dans six milieux de culture cellulaire différents, à 37 °C pendant 72 heures. Parmi ces milieux, le RPMI a présenté les meilleurs résultats en termes de stabilité, ce qui en a fait le milieu privilégié pour les essais cellulaires. Les Pin1-PROTACs ont été testés sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses : cancer de l’ovaire (IGROV1, SKOV3), cancer du poumon (A549), cancer du sein (MCF7) et myélome multiple (MM1.R). La présence de Pin1 ainsi que de la ligase CRBN dans ces lignées a été confirmée par immunofluorescence. Les tests de cytotoxicité et de viabilité ont révélé que, de manière générale, les Pin1-PROTACs ne sont pas cytotoxiques mais présentent une activité antiproliférative. Des analyses par Western blot ont également été réalisées. Aucune dégradation de Pin1 n’a été observée après incubation des trois premiers PROTACs testés avec les cellules SKOV3, MCF7 et MM1.R pendant 6, 24 ou 72 heures, même à des concentrations élevée (50 μM). En revanche, le quatrième PROTAC a montré une réduction de 35 % des niveaux de Pin1 dans les cellules MM1.R et MCF7 à 40 μM. L’évaluation des huit autres Pin1-PROTACs est en cours.

Ce projet a posé les bases d’une approche novatrice pour cibler Pin1, une protéine oncogénique clé l considérée comme non ciblable (« undruggable »). En exploitant la stratégie PROTAC, nous avons développé une série de dégradeurs ciblant Pin1, ainsi qu’une série d'inhibiteurs de Pin1 "clickable" and perméables aux cellules. Ces nouveau inhibiteurs présentant un potentiel à la fois thérapeutique et en imagerie. Les résultats obtenus jusqu’à présent ouvrent plusieurs perspectives prometteuses pour les recherches futures.

1. Optimisation de l’efficacité de dégradation

L’identification préliminaire d’un composé partiellement actif ouvre la voie à l’optimisation de l’architecture des Pin1-PROTACs ainsi qu’à l’exploration de stratégies alternatives, comme le recrutement de différentes ligases E3, afin d’améliorer la puissance et la sélectivité.

2. Localisation subcellulaire de Pin1 et dégradation

Des test de dégradation de Pin1 spécifiques à certains compartiments cellulaires sont en cours. Ils fourniront des informations essentielles sur l’influence de la localisation de Pin1 sur sa dégradation, permettant une conception plus rationnelle des PROTACs à l’avenir.

3. Auto-assemblage intracellulaire

Le développement prévu de l’auto-assemblage intracellulaire des PROTACs pourrait considérablement améliorer leur pénétration cellulaire et leur efficacité thérapeutique. Cette direction innovante pourrait permettre de surmonter les limitations liées à la taille, à la polarité et aux propriétés pharmacocinétiques des PROTACs classiques.

4. Outil pour la biologie fonctionnelle

Au-delà de l’aspect thérapeutique, les Pin1-PROTACs constituent un outil de recherche puissant pour une extinction aiguë et réversible de la protéine dans des modèles biologiques complexes, y compris chez les grands animaux, où les approches génétiques rencontrent des limites.

5. Expansion thérapeutique

Bien que le cancer reste la cible principale, l’implication de Pin1 dans les maladies neurodégénératives et virales ouvre la voie à des applications thérapeutiques plus larges à l’avenir.

Dans l’ensemble, ce projet positionne les Pin1-PROTACs à l’intersection de la chimie biologie, de la chimie médicinale et de la médecine translationnelle. Il ouvre de nouvelles perspectives non seulement pour le développement de thérapies anticancéreuses, mais aussi pour la compréhension des mécanismes biologiques fondamentaux et l’amélioration de la "ciblabilité" de protéines difficiles à atteindre.

La dégradation ciblée des protéines est une nouvelle modalité puissante dans la chimie biologique et la découverte de médicaments, ayant émergé au cours de la dernière décennie comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Les « PROteolyse TArgeting Chimeras » (PROTACs) sont des molécules bifonctionnelles constituées d'un ligand pour la Protéine Cible d'Intérêt (POI) et d'un ligand pour une ubiquitine ligase E3 qui sont joints de manière covalente par un linker flexible. Mécaniquement, le PROTAC favorise le recrutement de la ligase E3 à proximité immédiate de la POI, formant ainsi un complexe ternaire. Cette proximité permet l'ubiquitination de la POI médiée par la ligase E3, suivie de sa reconnaissance et de sa dégradation consécutive par le système ubiquitine-protéasome (UPS). Grâce à leur mode d'action catalytique, les PROTACs présentent différents avantages par rapport aux inhibiteurs traditionnels (petites molécules). En particulier, les PROTACs peuvent cibler les protéines « undruggables ».
Pin1 est une peptidyl-prolyl isomérase (PPiase) multifonctionnelle, qui catalyse l'isomérisation cis-trans des liaisons amide Xaa-Pro dans les protéines. Dans les cellules, Pin1 sert de « timer moléculaire », activant ou désactivant les fonctions de ses multiples substrats phosphoprotéiques de signalisation, afin de contrôler l'amplitude et la durée de nombreuses réponses ou processus cellulaires. Pin1 est surexprimée dans la plupart des cancers et constitue donc une cible potentielle pour leur traitement. Cependant, bien que de nombreux inhibiteurs de Pin1 aient été identifiés, la majorité d’entre eux n’ont pas la spécificité, la perméabilité cellulaire et l’efficacité requises. En effet, Pin1, tout comme les autres PPIases, est considérée comme « undruggable ».
Afin de surmonter les problèmes liés au développement des inhibiteurs de Pin1, tout en profitant des atouts uniques de la stratégie PROTACs par rapport aux modalités de ciblage existantes (anticorps monoclonaux et petites molécules inhibitrices avant tout), ce projet se concentre sur le développement de Pin1-PROTACs. Ceux-ci seront construits avec l'objectif pionnier et innovant de dégrader intentionnellement et de façon contrôlée Pin1, et ce, pour traiter le cancer. Au-delà de leur utilisation en tant que potentiels médicaments, d'autres applications remarquables et polyvalentes seront explorées pour les Pin1-PROTACs. Dans cette optique, ils pourraient être utilisés, entre autres, comme nouveaux outils de recherche pour répondre aux questions concernant les nombreux rôles de Pin1 dans les processus physiologiques et les conditions pathologiques. En outre, les Pin1-PROTACs permettront d’apporter une nouvelle méthode pratique, rapide et réversible pour dégrader Pin1 globalement et rapidement chez les animaux vivants, pour lesquels les stratégies génétiques de knock-out ciblées pourraient s’avérer irréalisables.