Sélection de bactéries endosymbiotiques par la plante-hôte – SELECT

Nous avons étudié les différents mécanismes contrôlant le succès écologique des rhizobia de la plante Mimosa pudica, en nous appuyant sur différentes approches expérimentales.

Dans un premier temps, nous avons exploité une expérience d’évolution, développée dans l’équipe depuis de nombreuses années, visant à faire évoluer une bactérie phytopathogène en symbionte de Mimosa. Au cours de cette expérience, les bactéries ont progressivement acquis et amélioré leur capacité à former des nodosités et à y proliférer. En séquençant les génomes de ces bactéries évoluées expérimentalement, nous avons pu identifier les mutations responsables des améliorations symbiotiques observées et nous avons analysé quelle étape de l’interaction symbiotique s’améliorait le plus rapidement.

Nous avons ensuite étudié plus finement dans quelle mesure la plante hôte peut contrôler l’abondance des bactéries dans ses nodosités en fonction de leur niveau de fixation d’azote. En utilisant un rhizobium naturel de M. pudica, nous avons construit des souches mutantes plus ou moins affectées dans leur capacité à fixer l’azote, et nous avons mesuré la prolifération de ces souches dans les nodosités.

Pour mesurer l’effet de la compétition sur les populations rhizobiennes de M. pudica, nous avons ensuite constitué une collection de rhizobia naturels, que nous avons inoculés isolément, par paire, ou en groupe de 6 ou 8 souches sur leur plante hôte. Dans chaque cas, nous avons mesuré l’abondance de chaque souche bactérienne dans la plante, correspondant au produit du nombre de nodosités formées par chaque souche par leur prolifération au sein de chaque nodosité. Lorsque la présence d’une souche modifiait la fitness d’une autre (indiquant une interaction entre deux souches), nous avons ensuite analysé à quel stade du cycle de vie cette interaction s’établissait (vie dans la rhizosphère, entrée dans la racine ou prolifération dans les nodosités).

Enfin, nous nous sommes intéressés aux étapes tardives de cette symbiose : la senescence des nodosités. Nous avons étudié si la prolifération et la survie des rhizobia dans les nodosités matures et en senescence étaient dépendantes de la capacité de fixation d’azote des souches, ou de leur capacité à stocker des réserves carbonées.

L’étude des souches bactériennes évoluées expérimentalement a montré que les plantes exerçaient une forte pression de sélection sur l’entrée des bactéries dans les racines et que la capacité des bactéries à rentrer dans les racines était en partie couplée à la capacité à proliférer à l’intérieur des nodosités. En effet, parmi les mutations identifiées qui améliorent les capacités symbiotiques des bactéries, toutes avaient un effet positif sur l’entrée dans les racines, et certaines accroissaient également la prolifération des bactéries à l’intérieur des nodosités.

Dans un second temps, nous avons observé que la relation entre le niveau de fixation d’azote et la survie des bactéries dans les nodosités n’était pas linéaire. Des souches bactériennes présentant un niveau de fixation d’azote faiblement réduit ont une fitness équivalente à celle de souches qui ne fixent plus du tout d’azote. Il semble donc y avoir un mécanisme de palier dans le contrôle de la fixation d’azote, en deçà duquel la fitness rhizobienne est fortement réduite par la plante hôte.

Troisièmement, nous avons pu montrer que les interactions entre rhizobia étaient très fréquentes, et qu’elles se déroulaient principalement au moment de l’entrée des bactéries dans les racines. Ce résultat valide, de manière indépendante, le résultat obtenu avec les souches évoluées expérimentalement. Toutefois, nous avons aussi mis en évidence que des interactions pouvaient avoir lieu au cours d’étapes plus tardives, lors de la colonisation des nodosités. Nous avons en particulier identifié une souche qui avait un effet négatif sur la prolifération d’une autre souche lorsque ces deux souches colonisent des nodosités indépendantes d’une même plante. Nous avons aussi observé que les interactions détectées dans les inoculations par paires de souches étaient conservées dans des inoculations en communautés de 6 ou 8 souches. Ce résultat indique que le niveau de complexité biologique des communautés de rhizobia n’a pas d’effet significatif sur les interactions qui s’établissent entre paires de souches.

Enfin, nous avons montré que ni la fixation d’azote, ni la capacité à stocker des réserves carbonées n’avaient d’impact sur la survie des bactéries dans des nodosités en senescence. Par contre, l’analyse de nodosités matures a montré que les bactéries ne fixant pas d’azote accumulent plus de réserves carbonées, alors que les souches ne stockant pas de réserves carbonées ne fixent pas plus d’azote. Ce résultat montre que ces deux caractéristiques importantes des rhizobia ne sont pas soumises à un compromis physiologique bidirectionnel, au cours dulequel un investissement des bactéries dans une propriété induirait automatiquement une diminution de l’investissement dans l’autre propriété. Cela suggère également que certaines propriétés bactériennes intrinsèques (capacité à stocker des réserves) influent sur la manière dont la plante contrôle la fitness des rhizobia ne fixant pas d’azote.

Ce projet a permis de décrire et de quantifier les différents types de mécanismes contrôlant la fitness des rhizobia durant l’interaction symbiotique avec la plante Mimosa pudica.

Nous avons identifié un nouveau type d’interaction entre deux souches de rhizobia, se déroulant dans des nodosités indépendantes et menant à une diminution de fitness d’une des souches. Nous avons également montré que la relation entre fixation d’azote et fitness des rhizobia dans les nodosités n’était pas linéaire. Dans les deux cas, il serait intéressant d’étudier quels sont les mécanismes moléculaires qui sont impliqués dans ces processus, et de tester s’ils sont également observés dans d’autres associations symbiotiques rhizobia-légumineuses.

D’autre part, nos résultats, ainsi que certaines observations préliminaires, indiquent que l’état physiologique des organismes symbiotiques (stockage de réserves carbonées chez la bactérie, niveau d’exposition des plantes à la lumière) impacte sur la manière dont les plantes légumineuses contrôlent la prolifération bactérienne dans les nodosités. Ces observations ouvrent la voie à une caractérisation plus poussée de ces effets, qu’il serait intéressante de réaliser à la fois au laboratoire et dans des environnements naturels ou agricoles.

Enfin, l’étude de notre collection de souches rhizobiennes naturelles de Mimosa pudica a montré que des souches ayant des niveaux de fixation d’azote équivalents présentent des niveaux de viabilité très différents dans les nodosités. Cette observation rappelle le phénomène de différentiation terminale, bien décrit chez certaines légumineuses qui induisent un état physiologique très particulier chez les bactéries présentes dans leurs nodosités, et menant à une perte de viabilité. Cependant, il est généralement admis que ce phénomène est contrôlé uniquement par la plante. Il serait donc intéressant d’étudier, si ce phénomène de différentiation pourrait également être contrôlé par la souche bactérienne dans les nodosités de Mimosa pudica.

Les organismes eucaryotes sont exposés à des communautés microbiennes complexes qui influencent leur santé, leur développement et leur évolution. Au cours de l’évolution, les eucaryotes ont ainsi acquis plusieurs types de mécanismes leur permettant de contrôler leurs interactions avec les micro-organismes, afin de se défendre contre les agents pathogènes tout en autorisant la prolifération des microbes bénéfiques. Ces mécanismes génèrent de fortes pressions de sélection sur les micro-organismes symbiotiques. Il est donc important de décrire les effets de la sélection médiée par les hôtes sur les populations microbiennes pour comprendre, et éventuellement prédire, l’évolution des micro-organismes pathogènes et bénéfiques.

La symbiose rhizobium-légumineuses a un impact majeur sur les écosystèmes naturels et agricoles, et contribue à une part significative des flux globaux d’azote. Au cours de cette symbiose, les rhizobia sont hébergées dans des organes racinaires spécifiques, les nodules, où elles fixent l’azote atmosphérique et fournissent de l’azote organique sous forme d’ammonium à leur plante-hôte, en échange de sources de carbone. Les diverses souches composant les populations rhizobiennes des sols présentent des différences phénotypiques importantes, certaines souches étant très bénéfiques, d’autres ne fournissant que peu ou pas d’azote à leur hôte. Pendant l’interaction avec leur hôte, la fitness des rhizobia est déterminée par leur capacité à réaliser 3 étapes symbiotiques : la nodulation, la formation d’organes racinaires accueillant les bactéries ; l’infection, l’entrée et la prolifération des bactéries dans les cellules végétales ; et la fixation d’azote et le transfert d’ammonium à la plante. Ces trois étapes sont conjointement contrôlées par les génotypes des deux partenaires et par les conditions écologiques, dont la diversité de la communauté rhizobienne dans la rhizosphère.

SELECT va étudier comment la sélection médiée par la plante hôte contrôle la fitness bactérienne et l’évolution des phénotypes impliqués dans les 3 étapes symbiotiques, en exploitant trois systèmes expérimentaux complémentaires. Tout d’abord, une expérience d’évolution, dont l’objectif est de re-jouer au laboratoire l’émergence d’un nouveau rhizobium à partir d’une bactérie pathogène, sera analysée au niveau populationnel afin de décrire la dynamique d’évolution génétique et phénotypique ayant permis l’acquisition et l’amélioration des deux premiers traits symbiotiques, la nodulation et l’infection. Puis, des modifications génétiques seront réalisées chez une souche de rhizobium pour moduler sa capacité à fixer l’azote, afin d’établir une relation quantitative entre la fixation d’azote et la fitness bactérienne dans les nodules. Enfin, j’utiliserai une collection de souches naturelles de rhizobia pour comparer l’expression et l’évolution des phénotypes symbiotiques après inoculation d’une seule ou de plusieurs souches bactériennes sur la plante hôte. Les différents résultats expérimentaux seront intégrés par des approches de modélisation mathématique permettant d’analyser la contribution relative des différentes étapes symbiotiques à la fitness bactérienne.

Ainsi, SELECT couplera plusieurs approches (allant de la génétique et génomique bactérienne à l’évolution expérimentale et la modélisation mathématique) appliquées à divers systèmes expérimentaux pour obtenir une vision détaillée des facteurs déterminant la fitness bactérienne au cours d’une interaction mutualiste complexe. Les connaissances fondamentales sur la dynamique éco-évolutive des bactéries symbiotiques qui seront générées par SELECT pourraient permettre, à terme, d’améliorer les pratiques agro-écologiques en établissant des procédures de sélection de souches rhizobiennes performantes (à la fois compétitives pour la nodulation et efficaces pour la fixation de l’azote) et qui pourront être utilisées dans différents contextes écologiques et sur différentes plantes-hôtes.