Des outils de phosphorylation enzymatique pour comprendre le mode d'action des analogues de nucléotides anti-CoV-2 – PHOTONS

Les analogues de nucléosidiques (Nuc) jouent un rôle clé dans chaque traitement antiviral approuvé utilisé jusqu'à présent. Il est peu probable que la situation change radicalement dans la lutte contre le SRAS-CoV-2 responsable de la pandémie de COVID-19: le Nuc "Remdesivir" est le seul médicament approuvé à ce jour, mais nécessite une posologie prudente et n'est pas disponible oralement. Les Nuc ciblent la polymérase nsp12, agissant soit comme terminateurs de chaîne, soit comme agents mutagènes. Pour être actif, le Nuc doit être phosphorylé intracellulairement en nucléoside triphosphate (NTP) correspondant. Pour concevoir un nouveau Nuc puissant contre nsp12, nous devons caractériser le mode d'action des Nuc disponibles afin de guider la conception future et d'atteindre des propriétés améliorées. Cependant, une fois qu'un Nuc actif est identifié, la synthèse de son NTP est un goulot d'étranglement important qui doit être surmonté pour effectuer des études de mode d'action. Ceci est bien illustré par la difficulté et le coût importants pour obtenir la forme 5'-triphosphate du Favipiravir, un médicament antiviral actif à large spectre actuellement évalué dans de nombreux essais cliniques à travers le monde.
Le présent projet vise à donner un accès rapide et efficace aux NTs par des méthodes enzymatiques innovantes et à large spectre.
Le projet, sur une période de 12 mois, est divisé en 2 taches.
• La Tache-1 est dédiée à la production et à l'ingénierie d'enzymes impliquées dans les réactions de transfert de phosphate sélectionnées à partir des données de la littérature. L'innovation réside ici dans le choix des "phosphorylases", dont certaines n'ont jamais été explorées pour la phosphorylation des nucléosides. Les quelques méthodes disponibles, chimiques ou enzymatiques, sont trop spécifiques et l'efficacité dépend du nucléoside cible naturel ou modifié. Notre souhait est de faire de l'ingénierie des phosphorylases avec une tolérance accrue aux substrats pour développer une méthode à large spectre. Pour évaluer l'efficacité des enzymes seules ou en cocktail, nous prévoyons d'utiliser la technique d'ATP-métrie bioluminescente qui est rapide et à haut débit pour tester un grand nombre de conditions sur un grand nombre d'enzymes.
• La Tache-2 est dédiée à l'application du meilleur "cocktail de phosphorylases" pour conduire des réactions enzymatiques en cascade (ECR) sur les nucléosides naturels et à la validation des Nuc d'intérêt pour lutter contre la polymérase nsp12 des coronavirus. Nous prévoyons également de transposer la méthode sur des enzymes immobilisées pour faciliter la purification du produit et le recyclage des enzymes.
Les Nuc font partie de l'arsenal thérapeutique préféré des traitements antiviraux. Notre projet fournira à la communauté scientifique un moyen rapide et facile d'obtenir des nucléosides triphosphates (NTP), permettant des progrès dans l'étude de leur mode d'action et favorisant de nouvelles découvertes de nouveaux Nuc antiviraux à large spectre.