Microscopie 3D par illumination aléatoire – RIM-3D

Le grand défi de la biologie cellulaire et du développement est de proposer un modèle multi-échelle reliant l'action des macromolécules à la fonction cellulaire puis au remodelage du tissu biologique. Une application majeure est de comprendre comment le stress induit par des forces mécaniques ou des dommages à l'ADN entraine le cancer. Son étude requiert des observations à différentes échelles (de sub-100 nm au mm) qui sont actuellement fournies par des instruments différents ce qui rend difficile une compréhension globale et intégrée du processus. Un microscope capable d’imager la danse des protéines dans de larges volumes de tissus cellulaires serait un atout majeur pour l’essor des modèles intégrés en biologie.
Actuellement, le microscope de fluorescence est le meilleur outil pour observer en temps réel et sur de grands champs, la distribution de protéines spécifiques dans des échantillons vivants. Malheureusement, sa résolution, environ 300 nm en transverse et 1000 nm en axial, ne permet pas une analyse suffisamment fine des mécanismes moléculaires en jeu. Les microscopes super-résolus (STED, STORM,SOFI) présentent des résolutions sub-100 nm, mais leur toxicité et leur cadence d'image restreignent leur utilisation à l’observation de phénomènes lents sur de petits volumes. Pour l’instant, le meilleur compromis entre la résolution ( 100 nm transverse et 300 nm axiale) et l’utilisation pratique sur des échantillons vivants est obtenu
avec le microscope à éclairement structuré (SIM). Malheureusement, cette technique nécessite un contrôle parfait de l’illumination ce qui empêche son utilisation dans un milieu optique aberrant comme du tissu biologique.
Récemment, nous avons développé un microscope à éclairement aléatoire (RIM), qui allie la résolution des meilleurs SIM à la facilité d’utilisation et l’applicabilité du microscope de fluorescence standard. RIM consiste à éclairer l’échantillon avec une série de ‘speckles’ aléatoires et à reconstruire une image super-résolue à partir des statistiques de second ordre des données. Il est basé sur une analyse mathématique prouvant que la résolution d’un tel système peut être équivalente à celle de SIM. La statistique des speckles étant insensible aux aberrations, RIM devrait fonctionner dans des conditions inaccessibles à SIM. Ces deux dernières années, RIM a été implémenté dans une version simplifiée dans laquelle l’échantillon à reconstruire est considéré comme une fine tranche restreinte au plan focal (2D-RIM). Ses performances le positionnent déjà comme une des meilleures techniques de microscopie optique super-résolue pour l’étude du vivant (une résolution de 120 nm transverse et 300 nm axiale pour une cadence de 1-5 Hz). Cependant, il est clair que 2D-RIM n’exploite pas toutes les possibilités de RIM. En particulier, la prise en compte de la structuration tri-dimensionnelle du speckle et de la réponse impulsionnelle du microscope dans l’analyse des données devrait permettre d’améliorer de manière significative la résolution axiale et temporelle.
Dans ce projet, nous proposons d'étendre le principe de RIM dans les trois dimensions avec une analyse mathématique et un traitement des données appropriés, couplés à une instrumentation améliorée. Notre objectif est de fournir des images sur un grand champ de vue avec une résolution transverse de 100 nm et axiale de 200 nm et d'atteindre une cadence d'image de 10 à 30 Hz. 3D-RIM sera utilisé pour répondre à deux questions biologiques majeures pour lesquelles aucun microscope super-résolu actuel n’est opérationnel : l'interaction des cellules avec le tissu environnant pendant l'apoptose, qui nécessite de coupler une haute résolution spatiale à de grands champs de vue, et l'extrusion dynamique de la boucle de chromatine pendant la réparation de l'ADN, qui nécessite une haute résolution spatiotemporelle.