Elucider la machinerie enzymatique catalysant une cyclisation atypique d’alcaloïdes indoliques monoterpéniques à des fins d’ingénierie métabolique – MIACYC

Le projet MIACYC repose sur le développement d’un pipeline optimisé d’élucidation de voies de biosynthèse de produits naturels de plantes combinant des analyses métaboliques spatiales à des analyses transcriptomiques menées à l’échelle cellulaire et soutenues par l’utilisation de l’intelligence artificielle. A ce titre, le projet a intégré des approches de : - annotation approfondie du métabolome à l'aide de la LC-MS/MS et d'outils d'annotation in silico d'extraits de plantes et de milieux de bioconversion enzymatique pour assurer une caractérisation fine des AIM. - histolocalisation des AIM par MALDI-MSI suivie d'une récupération des cellules par microdissection capture laser (LCM) afin de déterminer leur site d’accumulation préférentiel - élucidations structurale et stéréochimique des AIM par RMN et chimie quantique (DFT, TD-DFT-ECD, HF/DFT-NMR). - séquençage de génomes d’espèces végétales productrices d’AIM afin de soutenir les analyses transcriptomiques et étudier la possible formation de clusters génomiques de gènes - analyses transcriptomiques menées à l’échelle des organes, de tissus (après capture) et de la cellule (single cell RNA seq) pour corréler accumulation des AIM et expression génique - de la surexpression de facteur de transcription hétérologues régulateurs de la synthèse des AIM couplé à de l’analyse RNA seq pour stimuler l’expression des gènes de biosynthèse - de la prédiction de gènes candidats par combination des analyses précédentes et soutenue par du machine learning. - des tests fonctionnels des gènes candidats par surexpression chez Nicotiana benthamiana ou Saccharomyces cerevisiae, tests en microsomes ou utilisant des protéines recombinantes - de la purification des AIM produits par HPLC préparative. Les résultats émanant de cette première série d’analyses ont également permis le développement de cellules usine productrices d’AIM. Cette approche de bioproduction à exploiter des approches de :

- intégration des gènes végétaux dans le génome des levures par CRISPR/Cas9 pour la création des cellules usines. - d’alimentation des levures par des précurseurs biosynthétiques halogénés pour assurer la synthèse d’AIM "new-to-nature". - de modifications de localisation subcellulaire des enzymes et de la formation de métabolons pour optimiser les flux de synthèse et contourner les limites de fonctionnement liées à l’expression de protéines dans un environnement différent.

- de la culture en bioréacteurs et du génie des procédés pour optimiser les taux de production des AIM par les levures.

Le projet MIACYC a abouti au développement d’un pipeline d’identification de gène de voie de biosynthèse d’AIM, particulièrement efficace et s’appuyant sur les plus récentes techniques d’analyse à l’échelle cellulaire. Celui-ci a permis des avancées notables dans la compréhension du métabolisme des AIM incluant : -l’identification d’un cytochrome P450 (CYP71) assurant de multiples réactions de cyclisation d’AIM et en particulier de type C-C et C-N. Ces réactions sont ainsi à la base de la formation de squelette strychnane (akuammicine), akuammilane (strictamine) et mavacuranes (épi-pléiocarpamine, cible principale du projet) chez A. scholaris et Catharanthus roseus (publié) - l’étude évolutive du clade CYP71 expliquant l’apparition des activités de cyclisation C-N chez les gentianales (publié) -la mise en évidence de la capacité de l’enzyme tabersonine 3-oxidase (T3O) de catalyser la cyclisation C-N de vincadifformine pour former la vincamine (seconde cible de MIACYC) (en cours de publication) -l’analyse scRNAseq d’A. scholaris combinée à la métabolomique spatiale qui a conduit à l’identification d’enzymes assurant la synthèse d'AIM majeurs d’A. scholaris (en cours de rédaction) - le séquençage de génome d’Apocynacées productrices d’AIM (Vinca minor, C. roseus, Tabernaemontana elegans, Voacanga thouarsii, Rauvolfia tetraphylla) (5 articles publiés) - l’identification de la dernière enzyme de synthèse d’ajmaline (AIM d’intérêt pharmacologique majeur) (publié) - l’identification d’un CYP71 assurant l’époxydation de la tabersonine formant la pachysiphine, précurseur de l’AIM anti-Alzheimer conophylline (publié) Fig 1-l’identification d’un mécanisme de régulation de l’enzyme centrale de la biosynthèse des AIM (strictosidine glucosidase, SGD) (non publié) - la combinaison de l'apprentissage automatique et du calcul empirique pour la validation structurelle du premier trimère naturel isolé de C. roseus (publié) - la découverte du premier exemple d’AIM hybride associant une unité vobasane et une unité pyrraline (publié) et premiers trimères vobasane-aspidospermane-aspidospermane isolés de Voacanga africana (publié) - la révision de la structure de la mélonine et mise en évidence d’un nouveau squelette d’AIM (méloninane) (publié) - la mise à jour de la plus large de base de données spectrales dédiées aux AIM (422 spectres MS/MS) et la conception d’un outil chimioinformatique générant des signatures spectrales spécifiques d’un squelette de produits naturels. Dans un second temps, ces connaissances ont été exploitées afin de développer des cellules usines productrices d’AIM. Nos résultats principaux incluent : -la création de cellules usines pour la bioproduction d’alstonine et de rauwolscine ainsi que leurs dérivés halogénés (2 articles publiés) -l’impact de la relocalisation subcellulaire d’enzymes sur le flux de synthèse des AIM en levure (non publié)

D’un point de vue scientifique, le projet MIACYC a permis la compréhension des mécanismes de cyclisation C-N dans la synthèse d’alcaloïdes d’intérêt pharmacologique. Ces connaissances pourront être transférées à la caractérisation de la synthèse d’autres métabolites naturels présentant des caractéristiques structurales similaires. Plus généralement, le pipeline de travail développé durant MIACYC sera aussi valorisable pour la caractérisation d’autres étapes clefs de la biogénèse d’alcaloïdes ou de produits naturels d’intérêt. Dans ce contexte, BBV et BioCIS ont à nouveau uni leur force pour identifier de nouveaux mécanismes inconnus d’alcaloïdes qui s’avèrent cruciaux pour générer des molécules de très hautes valeurs ajoutées. Ces mécanismes questionnent la communauté scientifique depuis plus de 50 ans et leur compréhension ouvrirait la porte à de nouvelles stratégies de bioproduction des composés anticancéreux. Ces travaux ont donc fait l’objet d’une nouvelle demande de financement auprès de l’ANR et ont également permis l’extension de notre réseau de collaborateurs participant à ce projet. Le développement du pipeline d’élucidation de voies de biosynthèse de produits naturels à d’ores et déjà des applications concrètes puisqu’il est l’un des éléments centraux du projet Horizon COMBO (Nº 101135438) débuté en 2024. La collecte d’échantillons (éponges, algues) étant maintenant achevé, la génération des données muti-omiques associées permettra l’exploitation du pipeline MIACYC pour prédire puis caractériser des gènes associés à la synthèse de métabolites marins d’intérêt à partir de l’autonome 2025. En parallèle, les progrès réalisés dans le développement de cellules usines productrices de métabolites d’intérêt serviront également de socle à la création et à l’application de stratégies de bioproduction d’alcaloïdes d’intérêt. Dans ce contexte, BBV a renforcé son partenariat avec un groupe industriel implanté en région Centre et sollicité des fonds complémentaires auprès de la région Centre-Val de Loire pour l’acquisition d’un nouveau bioreacteur de 50 litres et d’une centrifugeuse dédiée qui permettront d’assurer le scale-up de la production de ces composés classés dans la catégorie CMR (cancérogènes, mutagènes, toxiques pour la reproduction). L’acquisition d’un tel équipement permettra donc d’assurer les montées en volume de culture dans un contexte de contrôle total des risques pour les opérateurs et accélèrera les possibilités de transfert au partenaire industriel.

La diversité moléculaire des alcaloïdes repose sur une machinerie enzymatique complexe amenant la formation de structures uniques, responsables de propriétés pharmacologiques spécifiques. Depuis quelques années et en particulier durant cette période, l’utilisation médicamenteuse de ces alcaloïdes est sérieusement affectée par des limites d’approvisionnement causées par leur faible synthèse in planta et par la surexploitation des ressources naturelles dont ils sont issus. Elucider les voies de biosynthèse correspondantes pourrait apporter des solutions en permettant le transfert de ces voies dans des organismes hétérologues pour un approvisionnement alternatif d’alcaloïdes d’intérêts par ingénierie métabolique. A l’heure où les principales voies de biosynthèse ont été identifiées, il apparaît indispensable de se concentrer maintenant sur les réactions plus originales assurant la formation d’alcaloïdes moins emblématiques mais dont le potentiel reste important. MIACYC propose ainsi de développer une procédure efficace d’élucidation de voies via l’identification des enzymes impliquées dans une cyclisation atypique de trois alcaloïdes majeurs (pléiocarpamine, vincamine et strychnine) puis d’assurer leur synthèse en levure et à terme celle de leur dérivés. Cette procédure d’élucidation originale repose sur la combinaison d’approches d’étude à l’échelle « single cell » de l’accumulation des alcaloïdes et des transcrits spécifiquement exprimés dans chaque type cellulaire pour tirer profit des compartimentations spatiales spécifiques existantes chez les plantes accumulatrices d’alcaloïdes et en particulier Alstonia sp. Le transfert en levures des gènes ainsi identifiés par CRISPR/Cas9 au niveau de hot-spots du génome permettra la création de « cellules usines » facilement cultivables pour la production d’alcaloïdes en bioréacteurs. Enfin, enrichir et combiner le panel d’enzymes de synthèse permettra de synthétiser de nouveaux composés aux propriétés variées.