Détection de la thrombo-inflammation par imagerie par résonance magnétique moléculaire ciblant le Facteur Von Willebrand – FlaMRIng

Les membres du consortium ont généré deux bibliothèques de nanobodies ciblant le VWF murin et humain via le phage display. Cette méthode permet de sélectionner des phages exprimant des anticorps spécifiques à un antigène immobilisé. Les phages sélectionnés ont été testés par ELISA afin de confirmer leur liaison et d’identifier ceux présentant la plus forte affinité. Les nanobodies retenus ont ensuite été séquencés, exprimés dans E. coli et purifiés.

Pour contourner la formation rapide d’une couronne protéique autour des particules circulantes, nous avons développé un nanobody bispécifique (KB-V6F6) ciblant à la fois le fibrinogène et le VWF. Ce nanobody a été conjugué à des MPIO. Nous avons aussi étudié d’autres aspects critiques de la thrombo-inflammation, tels que l’adhérence des leucocytes à la paroi vasculaire et l’activation des cellules endothéliales, signalée par l’expression de VCAM-1. À cette fin, nous avons produit des MPIOs conjugués de manière covalente à un anticorps monoclonal commercial anti-VCAM-1 et à un anticorps anti-CD45, ciblant respectivement les cellules endothéliales activées et les leucocytes adhérents.

Toutes les expériences in vivo ont été réalisées sur des souris Swiss mâles de 6 à 12 semaines. Nous avons utilisé des modèles murins de thrombo-inflammation induite par injection intracérébrale de LPS ou d’histamine, ainsi qu’un modèle d’hémorragie sous-arachnoïdienne par injection préchiasmatique de sang artériel frais. L’IRM moléculaire in vivo a été effectuée sur un système Pharmascan 7-T/12 cm avec bobines de surface (Bruker, Allemagne). Les images cérébrales ont été obtenues par IRM T2* sensible au fer avant et après injection intraveineuse de MPIOs.

Pour valider nos résultats, nous avons également réalisé des analyses de RT-qPCR pour l’expression des gènes VCAM-1 et VWF dans des échantillons cérébraux collectés à différents moments, de la microscopie à immunofluorescence sur coupes cérébrales colorées pour VCAM-1, VWF et marqueurs endothéliaux, ainsi que des dosages ELISA plasmatiques pour mesurer les concentrations de VWF dans diverses conditions expérimentales.

Les premières études ont consisté à conjuguer ces MPIO à des nanobodies anti-VWF et à les évaluer dans un modèle de thrombo-inflammation induite par le LPS. Aucun signal spécifique n’a été détecté. Afin d’en comprendre les raisons, des expériences comparatives ont été menées avec des MPIO couplés à un nanobody anti-VCAM-1, une cible validée dans notre laboratoire pour l’imagerie de l’inflammation. De manière similaire, les MPIO conjugués aux nanobodies n’étaient pas détectables, contrairement aux MPIO couplés à des anticorps entiers anti-VCAM-1. Des expériences supplémentaires de compétition avec des anticorps ont apporté des éléments en faveur de notre hypothèse : en raison de la petite taille des nanobodies, la couche de fibrinogène qui se forme rapidement autour des MPIO les masque, les empêchant ainsi d’atteindre sa cible.

Nous avons alors exploré d’autres approches afin de contourner cette impasse méthodologique : nous avons développé un nanobody bispécifique se liant au VWF et au fibrinogène, capable de reconnaître simultanément les deux antigènes. Les expériences in vivo ont permis de détecter un signal spécifique dans un modèle de thrombo-inflammation cérébrale induite par injection intracérébrale d’histamine, mais insuffisant pour permettre une imagerie IRM du VWF dans des modèles plus pertinents sur le plan clinique.

Dans le cadre de ce projet, nous avons donc réorienté nos efforts vers d’autres acteurs clés de la réponse thrombo-inflammatoire, en particulier les leucocytes adhérents et les cellules endothéliales activées. Cibler les leucocytes qui utilisent le VWF pour adhérer à la paroi vasculaire, permet une détection indirecte du VWF : nous avons développé une méthode permettant de suivre ces cellules (CD45+) à l’aide de particules superparamagnétiques phagocytées in situ. Les résultats obtenus dans un modèle d’AVC ischémique suggèrent que cette approche permet de détecter les leucocytes adhérant à la paroi vasculaire au stade subaigu de l’événement. Cependant, cette méthode s’est révélée insuffisamment sensible pour détecter la réaction thrombo-inflammatoire dans des modèles expérimentaux présentant des lésions neurovasculaires plus légères, tels que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA).

Enfin, nous avons évalué la pertinence de l’immuno-IRM ciblant des protéines exposées de manière stable à la surface endothéliale comme marqueurs de la thrombo-inflammation. Dans le modèle de HSA, l’imagerie ciblant la molécule VCAM-1 a montré une augmentation marquée de son expression dans le cerveau 24 heures après l’événement, suivie d’un retour progressif à un niveau basal au bout de 7 jours. Parallèlement l’expression du VWF dans le cerveau a présenté une évolution temporelle similaire à celle de la VCAM-1. Cette augmentation a également été observée dans le sang, et des analyses complémentaires ont confirmé une libération importante de VWF par les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux à ce stade précoce.

Le développement d’outils de l’immuno imagerie de nouvelle génération pour la thrombo-inflammation doit combler le fossé entre le succès expérimental et l’applicabilité clinique. À partir des résultats de ce projet, les perspectives suivantes dessinent la voie vers des agents d’imagerie biodégradables et transposables en clinique :

• Transition vers des agents de contraste biodégradables : Un obstacle majeur à la traduction clinique de l’immuno-IRM est la persistance à long terme des MPIO dans l’organisme. Bien qu’efficaces pour des preuves de concept précliniques, les MPIO classiques ne disposent pas d’un mécanisme clair de dégradation et d’élimination.

• Développement des M3P : Les travaux futurs devraient se concentrer sur le raffinement des particules magnétiques microscopiques à matrice (M3P). Ces particules exploitent un mécanisme d’auto-assemblage de nanocristaux de magnétite recouverts de catéchol, offrant potentiellement un cadre plus biocompatible et biodégradable que les MPIO traditionnels.

• Profil de sécurité : Il est essentiel de développer des sondes capables d’être métabolisées naturellement ou éliminées par le système réticulo-endothélial sans accumulation toxique, pour garantir la sécurité des patients et faciliter l’approbation réglementaire.

L’« effet de masquage » provoqué par la formation rapide d’une couche protéique adsorbée, notamment l’adsorption de fibrinogène, reste un verrou technique important pour le ciblage basé sur les nanobodies. Des solutions pour contourner cette limitation peuvent être envisagées :

• Optimisation structurelle : Bien que le construct bispécifique ait montré que la courone protéique pouvait servir de « point d’ancrage moléculaire », sa sensibilité actuelle reste insuffisante pour une IRM fiable du VWF.

• Amélioration de l’exposition : Les recherches futures devront se concentrer sur l’optimisation de la présentation des nanobodies à la surface des particules afin qu’ils dépassent la couche protéique. Cela pourrait passer par l’utilisation d’espaces chimiques avancés ou de constructs multimériques pour augmenter l’avidité de liaison.

Enfin, ce projet a démontré que l’imagerie de l’activation endothéliale via VCAM-1 ou le suivi des leucocytes adhérents permet d’identifier précocement les lésions cérébrales dans des modèles tels que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA). Étant donné que le VWF est libéré presque instantanément à partir des corps de Weibel-Palade lors d’une lésion, il demeure le candidat « référence » pour une imagerie clinique sensible au facteur temps. La traduction de ces approches permettrait aux cliniciens de détecter les lésions vasculaires avant que des dommages tissulaires irréversibles ne surviennent, ouvrant la voie à une intervention précoce par des thérapies anti-thrombo-inflammatoires ciblées.

• Texier, A., Lenting, P. J., Denis, C. V., Roullet, S., & Christophe, O. D. (2023). Angiopoietin-2 binds to multiple interactive sites within von Willebrand factor. Research and practice in thrombosis and haemostasis, 7(7), 102204. doi.org/10.1016/j.rpth.2023.102204

• Lenting, P. J., Texier, A., & Casari, C. (2023). von Willebrand factor: from figurant to main character in the scene of inflammation. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH, 21(4), 710–713. doi.org/10.1016/j.jtha.2023.01.014


• Martinez de Lizarrondo, S., Jacqmarcq, C., Naveau, M., Navarro-Oviedo, M., Pedron, S., Adam, A., Freis, B., Allouche, S., Goux, D., Razafindrakoto, S., Gazeau, F., Mertz, D., Vivien, D., Bonnard, T., & Gauberti, M. (2022). Tracking the immune response by MRI using biodegradable and ultrasensitive microprobes. Science advances, 8(28), eabm3596. doi.org/10.1126/sciadv.abm3596

• Texier, Alexis, “ La cellule endothéliale au croisement de l'angiogenèse, la transplantation hépatique et l'imagerie de la neuroinflammation”, PhD thesis in Physiology and Pathophysiology, supervised by Peter Lenting and co-supervised by Stéphanie ROULLET. Université Paris Saclay, 2024.

La thrombo-inflammation est un mécanisme physiopathologique clé dans de nombreuses pathologies. Elle est causée par l’activation des cellules endothéliales dans les tissues en souffrance, entraînant une microthrombose secondaire qui amplifie les dommages tissulaires. A ce jour, les techniques d’imagerie disponibles ne détectent que les conséquences de la thrombo-inflammation. Ainsi, la possibilité de détecter les premières étapes de la thrombo-inflammation par imagerie permettrait non seulement d’améliorer notre connaissance des pathologies thrombo-inflammatoires, mais aussi d’offrir une fenêtre thérapeutique pour prévenir les atteintes irréversibles. Dans ce projet, nous souhaitons développer une méthode d’imagerie de la thrombo-inflammation en utilisant l’imagerie moléculaire par résonance magnétique. Cette méthode sera ensuite utilisée dans des modèles expérimentaux de pathologies thrombo-inflammatoires comme l’AVC, l’hémorragie sous arachnoïdienne et l’inflammation systémique.