Approche combinée d’optogénétique et de thérapie cellulaire à l’aide de cellules souches humaines pour la restauration visuelle – OPTOSTEM
Ingénierie de photorécepteurs dérivés de cellules souches pour améliorer la restauration visuelle
Restauration visuelle par combinaison de la thérapie cellulaire et de l'optogénétique
Restauration visuelle par combinaison de la thérapie cellulaire et de l'optogénétique
En raison de l’absence de traitement curatif des maladies dégénératives de la rétine, les stratégies de thérapie cellulaire visant à remplacer les cellules dégénérées font l'objet d'une attention considérable. Bien que l'approche basée sur la transplantation de photorécepteurs soit très prometteuse, des résultats fonctionnels limités ont été obtenus jusqu'à présent, probablement parce que les précurseurs de photorécepteurs transplantés n'ont pas réussi à maturer fonctionnellement, à savoir développer des segments externes leur permettant de capter la lumière. Nous proposons ici consiste à combiner la thérapie cellulaire basée sur l’utilisation des cellules souches pluripotentes (iPS) et l'optogénétique afin de conférer une sensibilité à la lumière aux cellules transplantées. Nous introduirons un optogène spécifique (pompe à chlorure hyperpolarisante) dans les cellules iPS pour produire des photorécepteurs fonctionnels basés sur l'activité de cette opsine microbienne, même en l'absence de segments externes correctement formés. L'avantage majeur de notre stratégie est donc la synergie entre le remplacement cellulaire et la thérapie optogénétique qui permet de restaurer à la fois la structure de la rétine avec des dérivés de cellules souches et la fonction visuelle avec des opsines microbiennes. Le deuxième grand problème que pose l'utilisation des cellules iPS humaines pour la thérapie cellulaire est la survie des dérivés de cellules souches greffées dans les modèles de xénogreffes, généralement utilisés pour valider les avantages de la transplantation de cellules dans les maladies neurodégénératives. Étant donné que la xénotransplantation chez les rongeurs immunodéprimés ne peut pas modéliser la réponse immunitaire de l'hôte à des greffes transgéniques et allogéniques spécifiques, elle ne peut pas vraiment prédire le résultat de l'efficacité de la transplantation chez l'homme. Nous proposons ici d'évaluer la transplantation chez des primates non humains dans des situations allogéniques via la génération de photorécepteurs dérivés de cellules iPS de macaques avec des haplotypes correspondants ou non à ceux des macaques receveurs.
WP-1.1 Ingénierie génétique des cellules iPS humaines
WP-1.2 Génération et sélection de précurseurs de photorécepteurs à partir des cellules iPS humaines modifiées
WP-1.3 Validation fonctionnelle in vitro des précurseurs de photorécepteurs humains modifiés
WP2.1 Ingénierie génétique des cellules iPS de macaque avec des haplotypes CMH spécifiques
WP-2.2 Génération et évaluation fonctionnelle de précurseurs de photorécepteurs à partir de cellules iPS de macaque modifiées
WP-3.1 Phénotypage du modèle macaque de dégénérescence des photorécepteurs avant transplantation
WP-3.2 Caractérisation phénotypique et fonctionnelle de macaques greffés avec différents précurseurs de photorécepteurs modifiés
WP-1.1 Ingénierie génétique des iPSCs humaines
Pour cibler l’expression de l’opsine microbienne Jaws dans les cellules photoréceptrices, nous avons utilisé l’édition génomique CRISPR/Cas9 pour créer des lignées d’iPSCs knock-in exprimant Jaws-GFP sous le contrôle du promoteur Crx ou du promoteur spécifique des cônes Pr1.7, en insérant la construction dans le locus AAVS1 validé. Les clones obtenus ont été contrôlés pour l’insertion correcte, l’intégrité chromosomique et la conservation de la pluripotence.
WP-1.2 Génération et sélection de précurseurs de photorécepteurs à partir d’iPSCs humaines modifiées optogénétiquement
À partir des lignées CRX_Jaws-GFP et Pr1.7_Jaws-GFP, nous avons produit des organoïdes rétiniens selon notre protocole 3D établi. La fluorescence GFP a permis de suivre l’engagement photorécepteur, confirmé par immunofluorescence. Les organoïdes ont ensuite été dissociés, et les photorécepteurs isolés par tri magnétique ciblant l’antigène CD73, avec une survie supérieure à 80 %.
WP-1.3 Validation fonctionnelle in vitro des précurseurs de photorécepteurs humains modifiés optogénétiquement
Des expériences d'électrophysiologie, de type Patch-Clamp ont montré des réponses électriques à un flash lumineux dans les cellules GFP (identifiées par imagerie bi-photonique) des organoïdes CRX_Jaws-GFP et KI Pr1.7_Jaws-GFP. Cette réponse possède les caractéristiques attendues de Jaws et est bien dû à la présence de Jaws, car absente dans les photorécepteurs non modifiés.
WP2.1 Ingénierie génétique d’iPSCs de macaque avec des haplotypes CMH spécifiques
La génération d’iPSCs modifiées optogénétiquement (idem WP1.1) n’a malheureusement jamais pu aboutir à partir des différentes lignées d‘iPS de macaque (partenaire 2).
WP-2.2 Génération et évaluation fonctionnelle de précurseurs de photorécepteurs à partir d’iPSCs de macaque modifiées optogénétiquement
Non réalisé
WP-3.1 Phénotypage du modèle macaque de dégénérescence des photorécepteurs avant transplantation
Cinq animaux ont reçu un patch de silicone sous-rétinien pour ablation des photorécepteurs. Le suivi OCT a confirmé une réduction de la couche photoréceptrice 6–9 mois après implantation. Seuls deux macaques ont pu être menés à terme : retrait de l’implant 8–9 mois post-opération, greffe de photorécepteurs Jaws trois mois plus tard, puis sacrifice trois mois après la greffe pour analyse histologique.
WP-3.2 Caractérisation phénotypique et fonctionnelle de macaques greffés avec différents précurseurs de photorécepteurs modifiés optogénétiquement
Caractérisation phénotypique en cours sur deux animaux xénogreffés (iPS humaines) ; aucune analyse effectuée pour les allogreffes (iPS macaques).
Les résultats de cette étude sont importants pour documenter le potentiel thérapeutique de la combinaison de l’optogénétique et de la thérapie cellulaire en vue d’une future application clinique.
Suite à l'échec d'une partie du projet (greffes allogéniques), nous avons commencé fin 2024 à utiliser les cellules iPS modifiées optogénétiquement dans un modèle rongeur dystrophique immunodéficient. Ce modèle est adapté à l'étude de xénogreffes même s'il ne permet pas de répondre aux questions liées aux approches allogéniques qui seront utilisées à l'avenir chez l'homme. Ce modèle rongeur dystrophique immunodéficient permet néanmoins d'avoir un suivi à long-terme sur le devenir des cellules transplantées et de leur fonctionnalité.
En raison de l’absence de traitement curatif des maladies dégénératives de la rétine, les stratégies de thérapie cellulaire visant à remplacer les cellules dégénérées font l'objet d'une attention considérable. Bien que l'approche basée sur la transplantation de photorécepteurs soit très prometteuse, des résultats fonctionnels limités ont été obtenus jusqu'à présent. La récupération fonctionnelle précédemment observée peut être le résultat du transfert de matériel cytoplasmique des cellules transplantées vers les photorécepteurs hôtes restants, plutôt que par une réelle intégration dans la rétine du receveur. L'intégration fonctionnelle des photorécepteurs transplantés dans la rétine de l'hôte nécessite une connexion à la rétine interne de l'hôte mais aussi le développement de segments externes photosensibles, nécessitant une interaction avec l’épithélium pigmentaire sous-jacent. Dans les modèles de rongeurs dont la rétine est fortement dégénérée, les précurseurs de photorécepteurs transplantés n'ont pas réussi à développer des segments externes normaux avec une polarité correcte. Pour tenter de surmonter ces problèmes, la stratégie que nous proposons ici consiste à combiner la thérapie cellulaire basée sur l’utilisation des cellules souches pluripotentes (iPS) et l'optogénétique afin de conférer une sensibilité à la lumière aux cellules du donneur. Nous introduirons un optogêne spécifique (pompe à chlorure hyperpolarisante) dans les cellules iPS pour produire des photorécepteurs fonctionnels basés sur l'activité de cette opsine microbienne, même en l'absence de segments externes correctement formés. L'avantage majeur de notre stratégie est donc la synergie entre le remplacement cellulaire et la thérapie optogénétique qui permet de restaurer à la fois la structure de la rétine avec des dérivés de cellules souches et la fonction visuelle avec des opsines microbiennes.
Le deuxième grand problème que pose l'utilisation des cellules iPS humaines pour la thérapie cellulaire est la survie des dérivés de cellules souches greffées dans les modèles de xénogreffes, généralement utilisés pour valider les avantages de la transplantation de cellules dans les maladies neurodégénératives. Étant donné que la xénotransplantation chez les rongeurs immunodéprimés ne peut pas modéliser la réponse immunitaire de l'hôte à des greffes transgéniques et allogéniques spécifiques, elle ne peut pas vraiment prédire le résultat de l'efficacité de la transplantation chez l'homme. Nous proposons ici d'évaluer la transplantation chez des primates non humains (PNH) dans des situations allogéniques via la génération de photorécepteurs dérivés de cellules iPS de macaques avec des haplotypes correspondants ou non à ceux des macaques receveurs. Les modèles PNH sont aussi beaucoup plus pertinents que leurs homologues chez les rongeurs car leur rétine présente une anatomie et une fonction proche de celles de l'homme, essentiellement en raison de la présence d'une fovéa, la région spécifique ciblée par la thérapie cellulaire pour le remplacement des photorécepteurs.
Ainsi, nos objectifs spécifiques sont : i) d'intégrer par la stratégie CRISPR/Cas9 une opsine microbienne dans les cellules iPS humaines et de PNH ; ii) de générer et d'isoler une population homogène de précurseurs de photorécepteurs exprimant l’optogène issus des cellules iPS humaines et de PNH; et iii) d'évaluer les propriétés fonctionnelles de ces précurseurs de photorécepteurs modifiés dans un modèle macaque de dégénérescence des photorécepteurs. Les résultats obtenus seront essentiels pour documenter le potentiel thérapeutique de la combinaison de la thérapie optogénétique et de la thérapie à base de cellules souches en vue de développer de nouvelles thérapies sûres et efficaces pour les dégénérescences de la rétine humaine.
Coordination du projet
Olivier Goureau (Institut de la vision)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenariat
MIRCen DRF/IBF/MIRCEN/Laboratoire de Maladies Neurodégénératives: mécanismes, thérapie, imagerie
IdV Institut de la vision
Aide de l'ANR 557 155 euros
Début et durée du projet scientifique :
mars 2021
- 48 Mois
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