Ciblage thérapeutique et biologie chimique des chaperons d’histone à l'aide d'inhibiteurs de taille moyenne conçus rationellement – THERA-HCi

Dans des travaux antérieurs réalisés par le partenaire 2, la modélisation moléculaire et des méthodes itératives avaient permis de découvrir ip4, un peptide de haute affinité pour ASF1, dans lequel les séquences de H3 et H4 ont été optimisées et reliées par un connecteur peptidique. Malgré ses bonnes propriétés de liaison, ce peptide montrait une perméabilité membranaire particulièrement faible et une faible résistance à la protéolyse, limitant ainsi son utilité pratique. En nous inspirant de ces travaux, nous avons d'abord entrepris d'optimiser le connecteur pour relier un mime oligourée de l'hélice H3 découvert par les partenaires 1 et 2 (Sci Adv 2021, DOI : 10.1126/sciadv.abd9153 et aussi Chem Commun 2023 : 10.1039/D3CC01891A) et le brin β C-terminal de H4. Dans le projet THERA_HCi, plusieurs séries de chimères oligourée-peptide ont été synthétisés par synthèse sur support solide et les mesures d'affinité ont été réalisées par titrage calorimétrique isotherme (ITC) en utilisant la protéine ASF1 recombinante produite par le partenaires 2. Des informations plus précises sur ces interactions ont été obtenues par RMN et diffraction des rayons X des cocristaux de complexes entre les ligands et ASF1. Ces séries de molécules ont ensuite été évaluées pour leur propriétés de pénétration cellulaire (cytosol et noyau) par deux approches expérimentales complémentaires. Les propriétés de résistance des composés à la dégradation protéolytiques ont été évaluées sur du plasma humain. L'engagement de la cible par les meilleurs inhibiteurs a été validé sur des lysats cellulaire en western blot.

Ce workflow garantit que nos mimétiques du dimère H3-H4 à base de foldamères présentent non seulement une forte affinité pour ASF1B, mais aussi des propriétés favorables pour la pénétration cellulaire et l’activité biologique.

A partir de ces données encourageantes, le projet s'est ensuite focalisé sur l'évaluation cellulaire des inhibiteurs présentant le meilleur profil combiné de liaison à ASF1 et de pénétration cellulaire.

A ce jour, les résultats marquant du projet sont :

(1) La découverte de deux familles d'inhibiteurs de haute affinité pour ASF1.

Nous avons ainsi montré que l'approche basée sur les foldamères peut être étendue pour générer des mimes de la structure quaternaire de H3-H4 de taille moyenne, avec une série de poids moléculaire légèrement inférieur à 2,5 kDa et une nouvelle série de poids moléculaire < 2kDa. Ces molécules présentent une forte affinité (Kd dans la gamme du bas nanomolaire) pour ASF1B. En partant du foldamère dérivé de l’hélice H3, décrit précédemment, et en nous appuyant sur la structure du cocristal avec ASF1, nous avons suivi le workflow suivant : (i) introduction et optimisation du connecteur le foldamère mimant l’hélice H3 et le brin étendu dérivé de H4 ; (ii) remplacement partiel de la séquence native de H4 par un mimétique de brin beta afin de stabiliser davantage la conformation bioactive de la molécule et sa stabilité dans les fluides biologiques

(2) L'observation que certaines modifications introduites pour optimiser les molécules permettent d'améliorer conjointement l'affinité et la pénétration cellulaire.

(3) La résolution de plusieurs structures cristallographique des complexes entre les inhibiteurs et ASF1.

Ces structures à haute résolution valident complètement le design initial tout en apportant de nouvelles idées d'optimisation fines des molécules.

(4) La publication d'un premier article sur l'optimisation des mîmes de l'hélice H3 dans Chemical Communications en 2023 complété par plusieurs articles sur les chaperons d'histone et sur de nouvelles méthodes de stabilisation de peptides et de foldamères par macrocyclisation.

(5) les premiers résultats encourageant d'activité cellulaire, notamment sur des cellules de cancer du sein triple négatif (TNBC)

Au cours du projet THERA_HCi, nous avons mis au point une stratégie efficace basée sur les foldamères et la chimie peptidomimétique pour imiter et réduire la taille de la structure quaternaire du dimère d'histones H3-H4, aboutissant à la découverte de plusieurs familles de ligands de taille moyenne (1.8 kDa < Poids moléculaire < 2.5 kDa) et de haute affinité, pour la chaperon d’histones ASF1.

Certains des ligands chimériques peptide-oligourée identifiés ont une masse moléculaire inférieure < 2 kDa, mais reproduisent néanmoins avec efficacité le mode de liaison du dimère protéique naturel à la surface plate et étendue de ASF1. Grâce à une combinaison de conception guidée par la structure, de chimie des foldamères, de substitutions d'acides aminés soigneusement choisies pour optimiser la charge positive formelle, et de N-méthylation du squelette, nous avons également identifié des ligands pénétrant dans le cytosol des cellules et montrant une stabilité accrue dans le plasma humain.

A ce stade, nos résultats suggèrent que l'insertion de résidus urée à des positions spécifiques dans une chaîne peptidique peut être utilisée pour imiter les structures protéiques d'origine, mimer des séquences dipeptidiques et connecter des épitopes disjoints tout en augmentant la résistance à la dégradation protéolytique. Cette approche offre une voie alternative pour créer des inhibiteurs protéiques peptidomimétiques linéaires, stables et de faible poids moléculaire.

Des résultats encore préliminaires obtenus récemment dans le cadre du projet montre que plusieurs de ces ligands reconnaissent ASF1 dans un contexte cellulaire in vitro et sont des outils chimiques intéressants pour continuer d'étudier les effets de l'inhibition de l'interaction entre les histones et ASF1 dans les cellules. A cours et moyen terme, ces molécules seront évaluées de manière plus approfondies sur des lignées de cellules cancéreuses et sur des modèles de cancers du sein triple négatif

Le chaperon d’histones ASF1 joue un rôle crucial dans le maintien de l’information épigénétique portée par les histones H3-H4. La surexpression d’ASF1B induit la prolifération des cellules tumorales et constitue un marqueur performant de mauvais pronostique pour le cancer du sein. ASF1 est également impliqué dans le vieillissement cellulaire et est nécessaire au cycle de certains virus pathogènes. Ces propriétés font d’ASF1 une cible thérapeutique nouvelle et ont motivé la conception d’inhibiteurs peptidiques par l’un des partenaires du projet. Cependant, ces peptides pénètrent peu dans les cellules et sont dégradés rapidement in vivo par des protéases. Ce projet PRCE qui associe trois laboratoires français et une SME vise à développer par des approches peptidomimétiques variées des inhibiteurs aux propriétés pharmacologiques améliorées ainsi que des sondes moléculaires pour explorer l’effet de l’inhibition d’ASF1 dans les cellules et in vivo et en démontrer le potentiel thérapeutique.