Les mitochondries pour stimuler les capacités thérapeutiques des cellules souches mésenchymateuses pour l’ischémie cardiaque – MiMeTiC

Toutes les méthodes expérimentales nécessaires à la réalisation de notre projet, incluant la biologie cellulaire et moléculaire, l’immunologie, la biochimie, les manipulations animales et la greffe cellulaire, ainsi que l’imagerie cellulaire in vitro et in vivo, sont déjà maîtrisées dans les laboratoires des trois partenaires : partenaire 1 : AM. Rodriguez à l’IMRB à Créteil ; partenaire 2 : ML. Vignais à l’IRMB à Montpellier ; partenaire 3 : J. Fauconnier à PhyMedExp à Montpellier.

Le développement de notre projet sera assuré grâce à la disponibilité d’outils biologiques et technologiques uniques incluant:

(i) une banque de MSC isolées à partir de tissu adipeux provenant de 50 donneurs adultes sains. Le tissu adipeux a été choisi car il est facilement accessible et prélevable à des fins cliniques par simple liposuccion. Cette banque a été constituée par un sous-groupe du laboratoire du partenaire 1 situé à l’Établissement Français du Sang à Créteil. Cette banque est dédiée à des recherches fondamentales et précliniques. Notre projet sera mené avec des MSC dérivées du tissu adipeux provenant d’au moins 5 donneurs afin d’assurer la reproductibilité et la robustesse à la fois de la procédure et des résultats ;

(ii) le protocole breveté de Mitoception (brevet : WO 2016008937-A1) permettant le transfert rapide et quantitatif vers des cellules cibles de mitochondries préalablement isolées ;

(iii) le système photoacoustique LAZR-X (Visualsonics) pour le suivi in vivo des MSC et des mitochondries dans des cœurs post-infarctus du myocarde. L’imagerie photoacoustique est une approche hybride in vivo exploitant les propriétés acoustiques et optiques et permettant une analyse de pointe, en temps réel, des aspects anatomiques, fonctionnels, physiologiques et moléculaires. La propriété essentielle du système LAZR-X pour notre projet est sa capacité à associer l’imagerie morphologique cardiaque à la détection dynamique de marqueurs moléculaires tels que des cellules marquées par fluorescence et des colorants optiques. L’analyse infrarouge multispectrale (de 680 à 2000 nm) nous permettra de détecter simultanément les MSC, les mitochondries et l’hypoxie tissulaire tout en localisant ces signaux dans une anatomie en mode B à haute résolution (Vevo3100, Visualsonics).

Enfin, notre projet bénéficiera de l’ensemble des plateformes disponibles pour mener nos expériences, tant à Créteil qu’à Montpellier, incluant : (i) des salles de culture de niveau L2 et des plateformes techniques dédiées à la cytométrie en flux, à la biologie moléculaire, aux tests Luminex et ELISA ainsi qu’au métabolisme ; (ii) des animaleries permettant la chirurgie, la greffe cellulaire et la mesure des fonctions tissulaires ; et (iii) des systèmes d’imagerie photoacoustique multispectrale in vivo situés à PhyMedExp (Imagerie du petit animal de Montpellier, IPAM, Biocampus). La disponibilité du système couplé Vevo 3100–LAZR-X est unique et offre une possibilité technologique exceptionnelle pour

Les principaux résultats que nous avons obtenus sont les suivants :

1. Détermination de la concentration optimale de mitochondries exogènes pour le préconditionnement des MSC

Des expériences dose-réponse avec différentes concentrations de mitochondries isolées nous ont permis de déterminer la dose maximisant le potentiel thérapeutique des MSC réceptrices. Les mitochondries ont été isolées à partir de la lignée cellulaire de cardiomyocytes ventriculaires fœtaux humains RL-14, puis transférées dans des cellules hMADs, qui sont des MSC dérivées du tissu adipeux de jeunes donneurs.

2. Mécanismes d’internalisation par les MSC des mitochondries cardiaques exogènes

En réalisant des expériences de préconditionnement mitochondrial en présence d’inhibiteurs ciblant les principales voies d’endocytose, nous avons montré que les MSC internalisent principalement les mitochondries cardiaques via l’endocytose médiée par la clathrine dépendante de la dynamine.

3. Effets du transfert de mitochondries cardiaques sur le potentiel thérapeutique des MSC

Nous avons montré que le préconditionnement mitochondrial améliore les propriétés fonctionnelles des MSC, notamment l’activité antioxydante, la prolifération, ainsi que le potentiel pro-angiogénique, anti-fibrotique et anti-inflammatoire.

4. Altérations métaboliques induites par le préconditionnement mitochondrial

Nous avons mis en évidence que le préconditionnement avec des mitochondries cardiaques augmente la respiration et la glycolyse des MSC réceptrices, (Seahorse et qRT-PCR). Pour évaluer le rôle de la glycolyse dans la médiation de ces effets, les MSC ont été traitées avec l’inhibiteur de la glycolyse 2-désoxy-D-glucose (2DG) pendant l’exposition aux mitochondries. En présence d’inhibition de la glycolyse, nous avons observé que les mitochondries cardiaques ne stimulent plus les propriétés réparatrices des MSC, confirmant le rôle essentiel de l’activation glycolytique dans l’amélioration thérapeutique des MSC.

5. Efficacité thérapeutique des MSC préconditionnées aux mitochondries dans un modèle murin d’infarctus du myocarde

L’injection intracardiaque de MSC préconditionnées ries a été comparée à celle de MSC naïves dans un modèle murin d’infarctus du myocarde (IM). Les cœurs ayant reçu des MSC préconditionnées ont montré une amélioration de la fonction globale du ventricule gauche 21 jours après l’IM, par rapport à ceux traités avec des MSC naïves ou du HBSS.

L’imagerie photoacoustique myocardique a été utilisée pour évaluer la perfusion ventriculaire gauche (VG) en détectant les variations de saturation en oxygène (sO₂) dans les parois apicale et moyenne du VG infarci. Seuls les souris recevant des MSC préconditionnées aux mitochondries ont présenté une augmentation de la sO₂ dans les régions ischémiques. Ces résultats indiquent que le préconditionnement des MSC avec des mitochondries cardiaques améliore leur efficacité thérapeutique dans les cœurs ischémiques.

Nos résultats principaux ont montré que le préconditionnement mitochondrial augmente l’efficacité thérapeutique des MSC. De façon intéressante, nos résultats non encore publiés montrent que ce préconditionnement augmente de façon significative (d’un facteur 8 en moyenne), la sécretion de vésicules extracellulaires (EV) thérapeutiques ayant des effets anti-oxydants, pro-angiogéniques, anti-fibrotiques et anti-inflammatoires.

Les perspectives découlant de ce projet initial visent à élaborer des stratégies thérapeutiques efficaces pour le traitement des maladies cardiovasculaires, tout en cherchant à simplifier et à réduire les coûts d'utilisation clinique par rapport à ceux liés aux cellules souches mesenchymateuses (MSC). L'approche que nous souhaitons développer est une approche de thérapie acellulaire, où l'accent est mis sur l'optimisation de la production de sécrétome thérapeutique (comprenant les microvésicules et les exosomes) provenant des MSC par préconditionnement avec des mitochondries isolées. Cette démarche pourrait potentiellement améliorer l'efficacité des traitements tout en rendant leur mise en œuvre plus accessible dans un contexte clinique.

Les EV ainsi produites seront utilisées en remplacement de la greffe de MSC, pour réparer les lésions cardiaques. Ce protocole acellulaire présente des avantages considérables par rapport à la greffe de cellules. Outre ses atouts logistiques indéniables (stockage, stabilité, disponibilité, tolérance), cette approche est utilisable sur un grand nombre de patients sans problème de compatibilité immunologique et son coût est nettement inférieur à celui de la greffe de cellules.

La poursuite de nos taravux dans ce domaine nous permettra d’apporter la preuve de concept que le préconditionnement avec des mitochondries exogènes est une approche permettant d’optimiser la production d’EV thérapeutique par les MSC.

Après validation de cette preuve de concept, nous souhaitons développer une approche de thérapie acellulaire beaucoup plus ambitieuse, toujours dans un souci de simplifier le transfert vers la clinique, s’intégrant dans un programme de recherche plus vaste se décomposant en 2 axes supplémentaires. Le premier visera à produire à échelle industrielle les EV par microfluidique à partir de MSC préconditionnées avec des mitochondries. Le second axe a pour finalité de se passer de l’étape de pré-conditionnement mitochondrial qui exige également l’isolation d’un grand nombre de mitochondries avec un questionnement sur la source tissulaire à utiliser. Pour cela, nous identifierons et validerons le ou les cibles moléculaires mimant les effets du préconditionnement avec des mitochondries sur les MSC. Ces connaissances nous permettrons ensuite de générer des MSC modifiées génétiquement pour les cibles d’intérêt, MSC qui seront ensuite utilisées pour la production d’EV thérapeutiques.

Ces recherches devraient permettre d’optimiser l’obtention d’EV pour le traitement des maladies cardiovasculaires.

La réparation du myocarde suite à un accident ischémique tel qu’un infarctus est un défi majeur en médecine régénérative. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (MSC) constitue une approche prometteuse pour régénérer le cœur infarci, de par sa faisabilité et son innocuité. Néanmoins, les essais cliniques menés à ce jour ont révélé des bénéfices modestes de la greffe de MSC et la nécessité d’optimiser les protocoles de thérapie cellulaire. Différentes stratégies d’optimisation ont été développées, basées essentiellement sur des modifications génétiques ou des pré-conditionnements pharmacologiques des MSC. Néanmoins, ces stratégies restent difficilement transposables à la clinique en raison de problèmes de sécurité thérapeutique et d’efficacité. En parallèle, d’importants efforts ont été consacrés à la caractérisation des mécanismes moléculaires contrôlant les propriétés régénératives des MSC, dans le but d’exploiter ces connaissances pour le développement de thérapies cellulaires plus efficaces. Des études récentes ont montré que le comportement des MSC, résidentes dans le tissu ou après greffe, est contrôlé par leur microenvironnement tissulaire et que leurs propriétés régénératives sont activées par des signaux de danger libérés par les cellules rendues souffrantes suite à une lésion. Nous avons récemment montré que des mitochondries provenant de cellules souffrantes (cardiaques ou endothéliales) sont transférées dans les MSC et que ce transfert constitue un signal de danger capable d’activer les propriétés régénératives des MSC. Plus spécifiquement, nos travaux ont montré que ce transfert de mitochondries confère aux MSC un phénotype réparateur en promouvant leur passage d’un état quiescent à un état activé, qui se traduit par une stimulation simultanée de leurs fonctions pro-angiogéniques, anti-inflammatoires et cytoprotectrices. De plus, nous avons montré que l’activation des MSC s’accompagne de la stimulation de leur métabolisme et de leurs voies de signalisation cytoprotectives. Basé sur ces observations, notre projet de recherche a pour objectif de développer une approche efficace de thérapie cellulaire qui soit transférable à la clinique. Ce projet est fondé sur l’hypothèse que le transfert ex vivo de mitochondries exogènes aux MSC va mimer le transfert intercellulaire de mitochondries provenant des cardiomyocytes souffrants et qu’il va stimuler les propriétés réparatrices des MSC. Notre projet est structuré en 3 objectifs majeurs : (i) l’optimisation du protocole d’activation des MSC par transfert de mitochondries exogènes, (ii) la caractérisation in vitro des propriétés réparatrices des MSC pré-conditionnées par les mitochondries exogènes et (iii) la démonstration de l’efficacité thérapeutique des MSC pré-conditionnées par les mitochondries dans des modèles précliniques d’infarctus du myocarde. Le bien-fondé et la faisabilité de notre projet sont renforcés par la méthode de Mitoception que nous avons brevetée et qui permet de délivrer des mitochondries exogènes à des cellules cibles.
Notre stratégie d’optimisation de l’efficacité thérapeutique des MSC présente des avantages par rapport aux approches développées jusqu’à présent, en termes:
(i) de faisabilité en clinique. Le protocole de thérapie cellulaire consistera à isoler les MSC et les mitochondries à partir du patient à traiter, selon les bonnes pratiques de laboratoire. Les MSC sont déjà isolables en grade clinique, notamment à partir de lipo-aspirats et l’isolement des mitochondries ne nécessite pas de réactifs d’origine animale;
(ii) d’efficacité puisque notre stratégie devrait permettre de stimuler simultanément plusieurs propriétés régénératives des MSC.
D’un point de vue socio-économique, notre projet MiMeTic devrait ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement des cardiomyopathies ischémiques, en proposant une alternative complémentaire aux thérapies classiques (revascularisation coronarienne, pacemaker, traitement pharmacologique).