Agents de ciblage cardiaque pour une délivrance thérapeutique dans des cardiomyocytes lors d'une insuffisance cardiaque – CardioTarget

Biologie cellulaire

Dissociation cellulaire et culture de cardiomyocytes fraîchement isolés. Des études fonctionnelles ont été menées sur les cardiomyocytes. Nos hypothèses ont ensuite été validées dans un modèle ex vivo.

Cytométrie en flux : les cardiomyocytes ont été soumis à un marquage de viabilité cellulaire LIVE/DEAD conformément au protocole du fabricant, fixés au PFA et analysés par cytométrie en flux, avec un minimum de 10 000 événements par échantillon. Un tri a été effectué pour surveiller le nombre de cellules vivantes, le nombre de cellules marquées positivement et l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) par cellule.

Imagerie cellulaire : L'immunohistochimie (IHC) et l'immunocytochimie (ICC) ont été réalisées sur des coupes cardiaques (< 80 μm pour l'IHC) à l'UMS IPSIT. Pour l'ICC, toutes les acquisitions ont été réalisées sur un microscope confocal SP8, à l'installation de microscopie MIPSIT (UMS IPSIT), ou sur un disque rotatif à l'UMR144.

Études physiologiques

Perfusion de Langendorff : l'aorte du cœur de rat a été canulée et perfusée avec une solution de Krebs-Henseleit oxygénée à un débit constant afin d'obtenir une pression aortique stable de 80 mmHg. Une cartographie électrique a été réalisée afin de mesurer la fréquence cardiaque et la propagation du potentiel d'action. Les peptides ont été perfusés via un circuit de recirculation, puis de l'isoprotérénol (100 nM) a été perfusé afin d'évaluer la fonction cardiaque.

Formulation et caractérisation physicochimique

Formulation des liposomes : Les liposomes ont été préparés à partir d'une composition bien établie similaire à celle des liposomes approuvés cliniquement (c'est-à-dire N-(carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol 2000)-1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DSPEPEG), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) ou phosphatidylcholine de soja entièrement hydrogénée (HSPC) et cholestérol).

Ils ont été préparés par la méthode d'hydratation de film lipidique mince, suivie d'une extrusion répétée à travers des filtres à pores de 100 nm. La fonctionnalisation des liposomes avec des conjugués de ligands ciblés a été réalisée principalement par insertion postérieure de conjugués phospholipide-ligand afin d'ajuster avec précision le taux et la composition de la fonctionnalisation.

Caractérisation physicochimique : les formulations liposomales ont été caractérisées pour leurs propriétés colloïdales, notamment leur taille hydrodynamique par diffusion dynamique de la lumière et des mesures du potentiel zêta dans des électrolytes contrôlés. L'ultracentrifugation a permis de séparer les liposomes des peptides non associés, ce qui a permis une quantification séquentielle de l'encapsulation et de la fonctionnalisation.

1. Étude in vitro et ex vivo du ciblage cardiaque de SCHoP-PKI. SCHoP1 et SCHoP2 délivrent le peptide PKI 6-22 dans les cardiomyocytes. Avec ces peptides, 70 % des NRVM restent viables et 50 % internalisent le PKI.

SCHoP1-PKI se localise surtout dans le cytosquelette. SCHoP2-PKI se répartit dans tous les compartiments, surtout dans le noyau.

Sur des d'hiPSC-CM, SCHoP1-PKI réduit la fréquence de battement, mais pas la vitesse de conduction, contrairement à SCHoP2-PKI.

Dans des cœurs de rats ex vivo, ces peptides bloquent l'augmentation de la vitesse de conduction induite par l’isoprénaline. SCHoP1-PKI diminue partiellement les phosphorylations des cibles de la PKA, tandis que SCHoP2-PKI les réduit totalement.

Ces résultats confirment l'efficacité des peptides SCHoP pour cibler les cardiomyocytes.

2. La fonctionnalisation des liposomes a été envisagée par post-insertion à la surface de liposomes déjà formés, de molécules de ciblage couplées à un phospholipide PEGylé. Les liposomes utilisés (140 nm) sont rendus fluorescents de manière stable à la rhodamine. La post-insertion a d’abord été validée par un phospholipide-PEG couplé à la carboxyfluorescéine (CF). Cette technique a été transposée avec succès au cas du peptide de ciblage cardiaque SCHoP, après optimisation des micelles à base de DSPE-PEG-SCHoP. Le peptide de pénétration cellulaire TAT a également été incorporé aux liposomes. L’évaluation de l’efficacité de ciblage des liposomes fonctionnalisés a été réalisée sur des cultures primaires de cardiomyocytes ventriculaires de rats néonataux. Elle a montré que seuls les liposomes fonctionnalisés par SCHoP présentent une capture cellulaire supérieure par les cardiomyocytes que par les autres cellules non ciblées (fibroblastes et macrophages), ce qui valide la stratégie de ciblage du projet.

3. Cinétique et biodistribution des liposomes SCHoP-DiD. L’imagerie FLIT in vivo montre que les liposomes SCHoP1-DiD et SCHoP2-DiD s’accumulent principalement dans le foie (362–432 pmol) et les poumons (200–226 pmol) dès 20 min, avec une persistance à 3 h et 24 h. Le cœur reste faiblement ciblé (13–48 pmol).

L’analyse ex vivo confirme ces résultats : fluorescence élevée dans le foie (jusqu’à 2,8×10⁹ µW/cm²), la rate, les poumons et les reins, mais négligeable dans le cœur (1,78×10⁸ µW/cm² pour SCHoP1-DiD ; 5,9×10⁷ pour SCHoP2-DiD).

Conclusion : Les liposomes ciblent efficacement le foie et les poumons, mais un optimisation du ciblage cardiaque est nécessaire.

Nous avons identifié deux nouveaux ligands cardiaques, SCHoP1 et SCHoP2, capables de délivrer des agents fonctionnels aux cardiomyocytes in vitro et ex vivo. Ces avancées en matière de livraison ciblée de médicaments pourraient non seulement révolutionner les traitements afin d’améliorer les résultats cliniques des patients, mais aussi réduire le fardeau mondial des maladies cardiovasculaires.

Sur la base de ces données, deux brevets ont été déposés (INPI FR2506612 et FR2506614, juin 2025) pour chaque peptide SChoP. Par ailleurs, deux articles originaux sont prêts pour la soumission :

• Le premier valide la preuve de concept de la délivrance d’un agent thérapeutique fonctionnel aux cardiomyocytes in vitro et ex vivo.

• Le second caractérise la plateforme liposomale fonctionnalisée avec les SChoP.

La publication de ces résultats a été retardée en attendant la validation des brevets.

Malgré ces progrès significatifs, un travail considérable reste nécessaire pour exploiter pleinement le potentiel de SCHoP1 et SCHoP2. Nos résultats démontrent une preuve de principe chez de petits modèles animaux, in vitro et ex vivo, mais des études sur de grands animaux sont encore indispensables.

De plus, des études pharmacocinétiques (PK), pharmacodynamiques (PD) et de biodistribution des deux peptides doivent être menées chez des modèles de rongeurs, avec des contrôles appropriés. Des études de toxicité in vivo complètes (avec différents cargos, des doses multiples et des suivis longitudinaux) seront également nécessaires avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain.

Une étude de marché, réalisée par l’Université Paris-Saclay (UPSay), a permis d’identifier des partenariats industriels potentiels. Dans l’immédiat, nous allons candidater à un appel préclinique avec la SATT UPSay pour valider les études de PKPD et de biodistribution in vivo. Une fois ces validations obtenues, nous pourrons envisager une demande plus mature auprès de la SATT pour évaluer la faisabilité de traiter les maladies cardiaques via nos plateformes de ciblage cardiaque.

Pour améliorer la délivrance ciblée aux cardiomyocytes, les axes de recherche futurs devront inclure :

• Le développement de nanotransporteurs avancés.

• L’exploration de techniques innovantes de conjugaison de ligands et de mécanismes de libération de cargaisons.

• L’intégration de technologies émergentes, telles que l’édition génique ou les thérapeutiques à base d’ARN.

Ces avancées pourraient marquer une nouvelle ère en thérapeutique cardiovasculaire, offrant aux patients des options de traitement plus sûres et plus efficaces.

L'insuffisance cardiaque (IC) est l'une des principales maladies cardiovasculaires. Elle est définie comme l'incapacité du cœur à répondre aux besoins du corps. L'IC constitue un problème de santé majeur, touchant 1 à 2% de la population adulte dans les pays industrialisés. Au cours des dernières décennies, d’énormes progrès ont été réalisé dans le traitement de l’IC, cependant aucun remède n'existe et la mortalité à 5 ans reste très élevée (approximativement 50%). Une caractéristique de l'IC est l'activation persistante de la voie de signalisation ß-adrénergique/AMPc qui conduit à l'activation chronique de la protéine kinase-A (PKA) responsable du remodelage cardiaque, de l’apoptose des cardiomyocytes et du développement de la fibrose cardiaque. Les ß-bloquants sont à la base de la thérapie de l'IC. Cependant, ils sont responsables d’effets secondaires importants et sont inefficaces chez environ 50% des patients atteints d'IC. Par conséquent, il devient impératif d'améliorer et/ou de proposer de nouvelles thérapies pour traiter l'IC. Idéalement, ces nouvelles thérapies devraient reposer sur la délivrance rapide de molécules thérapeutiques spécifiquement au myocarde. Une telle stratégie améliorerait le traitement des maladies cardiovasculaires (les cardiomyopathies hypertrophiques, l'IC aiguë ou chronique, les troubles du rythme) et supprimerait ou minimiserait les effets secondaires indésirables.
Il a été décrit dans la littérature que les peptides CTP et PCM ont la capacité se lier préférentiellement aux cardiomyocytes et de les intérioriser. Cependant, la caractérisation de ces agents est limitée et leur efficacité de ciblage reste faible. Par conséquent, nous avons développé plus de 100 variants à partir des séquences peptidiques originales et nous avons sélectionné de nouveaux peptides optimisés de ciblage cardiaque préférentiel (PCCP). Nous pensons que nos PCCP offriront une nouvelle classe de produits thérapeutiques une fois couplés à une cargo-médicament pour le traitement de l'IC.
CardioTarget vise à développer une plate-forme d'administration efficace de médicaments ciblée au cœur défaillant. Pour cela, l'inhibiteur de la PKA (PKI) sera encapsulé dans des liposomes greffés avec les PCCP optimisés, permettant ainsi une délivrance rapide et efficace du PKI spécifiquement aux cardiomyocytes pour le traitement de l'IC. Au cours du projet, nous allons: 1/ Caractériser l'efficacité et la spécificité des PCCP couplé au PKI dans des modèles pharmacologiques (in vitro et ex vivo) à inhiber la PKA cardiaque; 2/ Développer des systèmes de délivrance originaux conjugués au PCCP pour améliorer leur stabilité plasmatique et la délivrance cardiaque in vivo; 3/ Évaluer l'efficacité des vecteurs thérapeutiques cardiaques spécifiques (liposomes greffés PCCP) dans l'administration de PKI comme thérapeutique dans un modèle physiopathologique de l'IC.
CardioTarget développera de nouvelles plateformes spécifiques de ciblage cardiaque afin de favoriser une délivrance efficace et préférentielle de médicament. Ces plateformes favoriseront le développement de nouvelles approches thérapeutiques (peptides ou acides nucléiques) pour le traitement des maladies cardiaques avec une amélioration de l'indice thérapeutique.