Developpement d'Aptamères ARN ciblant la NADPH oxydase DUOX1 comme approche thérapeutique pour traiter la fibrose pulmonaire – APFIBROX

La méthode SELEX consiste à sélectionner des aptamères liés à une cible exprimée à la surface des cellules. Ceci a nécessité d’identifier au préalable les conditions optimales d’adhésion des cellules au support. Une librairie d’aptamères ARN (10 puissance 15 molécules) modifiés chimiquement pour les rendre résistants a ainsi été incubée avec des cellules dont l’expression de DUOX1 à leur surface est induite par un antibiotique. Dans un premier temps la librairie a été incubée avec les cellules n’exprimant pas DUOX1 ceci afin d’éliminer les aptamères liés de manière non spécifique. Les molécules non liés ont été alors récupérées et incubées avec les cellules exprimant DUOX1. Les aptamères liés aux cellules ont ensuite été récupérés puis réamplifiés pour générer un nouveau pool d’aptamères qui a été utilisé pour un nouveau cycle de sélection. A chaque cycle de sélection les aptamères ont été analysés par séquençage et regroupés en famille. L’enrichissement de ces familles a permis d’identifier les aptamères potentiels. Ceux-ci ont ensuite été analysées pour leur propriété à inhiber l’activité génératrice de ROS de DUOX1 et à inhiber l’activation de la voie de signalisation cellulaire qui contrôle la fibrogenèse dans des fibroblastes isolés de poumons de souris.

Au cours ce projet 33 aptamères candidats prometteurs ont été identifiés. De ces 33 aptamères deux ont été sélectionnés sur la base de leur propriété à inhiber l’activité de DUOX1. Afin de déterminer les éléments cruciaux de leur séquence respective impliqués dans la reconnaissance de DUOX1 deux nouvelles librairies de variants de ces deux aptamères contenant 10% de mutations ont été synthétisées et utilisées pour deux cycle de SELEX. L’évaluation de l’enrichissement a montré que parmi les deux aptamères l’aptamère Dx1781 présentait un enrichissement nettement supérieur et semblait donc prometteur. L’incubation de cet aptamère avec des fibroblastes de souris a montré que celui-ci inhibait l’activation de la voie du TGF-beta, voie majeure de la fibrose.

Les maladies respiratoires chroniques, y compris la fibrose pulmonaire sont une cause importante de morbidité et de mortalité. La fibrose pulmonaire se caractérise par un dépôt excessif de matrice conduisant à une destruction de l’architecture pulmonaire et de manière ultime à une diminution de la fonction respiratoire. La fibrose idiopathique (FPI) est la forme la plus courante de fibrose pulmonaire, avec un taux de mortalité élevé. Elle résulte d’une activation aberrante des cellules épithéliales alvéolaires qui provoque une migration excessive, une prolifération et une activation des fibroblastes avec formation de foyers (myo) fibroblastiques et dépôt excessif de matrice extracellulaire. La nécessité de développer des traitements innovants pour la fibrose pulmonaire est apparue comme un défi thérapeutique important.
Un nombre croissant d’études révèle le rôle d’un stress oxydatif chronique dans la progression de la fibrose. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) ainsi que des marqueurs du stress oxydatif sont élevés dans la FPI et le niveau de ROS qui corrèle négativement avec la fonction pulmonaire peut prédire la sévérité de la maladie. Les cellules peuvent produire des ROS par l'activation et/ou l'induction de NADPH oxydases. Ces protéines membranaires constituent une famille d’enzymes qui comporte sept membres : cinq NOXs (NOX1-5) et deux dual Oxydases (DUOX1 et 2).
Les DUOXs génèrent de l’H2O2 à la surface des cellules. Nos données in vivo (Patients FPI, modèle murin de fibrose pulmonaire) montrent que l’expression de DUOX1 est induite dans le tissu fibreux, notamment dans les cellules épithéliales et dans les foyers myofibroblastiques. Les souris déficientes en DUOX1 (DUOX1+/- et DUOX1-/-) sont protégées de la fibrose pulmonaire expérimentale. L’analyse du mécanisme a révélé que DUOX1 via l’H2O2 qu’elle produit, amplifie et maintien l’activation de la voie de signalisation du TGF-B1, avec pour conséquence une activation chronique des fibroblastes et le développement de la fibrose. DUOX1 devient donc une cible thérapeutique. L’objectif de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante basée sur l'utilisation d'aptamères. Ces molécules sont des oligonucléotides (ADN ou ARN) qui peuvent se replier en structures 3D complexes et se lier à des cibles avec une affinité et une spécificité élevées en fonction de la complémentarité de forme, inhibant ainsi la fonction. Plusieurs thérapies aptamères pour d'autres maladies se sont révélées prometteuses dans les essais cliniques.
Le projet est divisé en trois tâches : Tâche 1 : sélection d’aptamères résistants aux nucléases, en chimie ARN 2’Fluoro-pyrimidine, dirigés contre la protéine DUOX1 en utilisant une stratégie de SELEX sur cellules entières. La lignée cellulaire HEK293 inductible pour DUOX1 sera utilisée à cette fin, Tâche 2: Identification et caractérisation fonctionnelle des candidats aptamères en analysant leur capacité à inhiber le processus de différenciation myofibroblastique induit par le TGF-B1 et ce, à partir de fibroblastes pulmonaires murins et humains et Tâche 3: évaluation de l’efficacité thérapeutique des aptamères sélectionnés en utilisant un modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine
Ce projet devrait conduire à l’identification d’aptamère(s) dirigés contre DUOX1 en tant qu’outils thérapeutiques prometteurs ayant le potentiel de contrer le processus pathologique de cette maladie pulmonaire chronique mortelle. De plus, au cours de la rédaction de cette demande de financement, il est apparu évident qu’une fibrose pulmonaire grave pouvait être induite par le nouveau coronavirus, le SRAS-CoV-2. En conséquence, nous pensons que ces aptamères pourraient également être utiles pour réduire la fibrose pulmonaire dans d'autres pathologies. Ce projet rassemble 2 équipes (C. Dupuy et F. Ducongé) et leurs savoir-faire, très complémentaires, associant une expertise en stress oxydant et NADPH oxydases et Aptamères.