Traitement ciblé des maladies thrombotiques – FightClot

Synthèse des microbulles : Les microbulles de poly-isobutyl cyanoacrylate (PIBCA) ont été obtenues par la polymérisation anionique du monomère IBCA à l'interface eau-gaz (Perfluorobutane) par cavitation acoustique à l'aide d'un sonificateur. Elles ont été purifiées par centrifugation puis filtrées à travers un tamis de 5 µm à l'aide d'une tamiseuse.

Caractérisation des microbulles de polymère : Concentration par analyse d'image ; taille et potentiel zêta par diffusion dynamique de la lumière ; composition par FTIR ; morphologie par imagerie confocale et microscopie électronique à balayage ; teneur en Fucoïdane par dosage du bleu de méthylène.

Les propriétés échogènes des microbulles in vitro ont été étudiées à l'aide d'un dispositif maison (fantôme et modèles d'éclatement ultrasonore).

L'Alteplase a été chargé sur les microbulles par une méthode d'adsorption et l'activité amidolytique et l'activité fibrinolytique de l'Alteplase chargé par le test PefaFluor et le modèle de gel de fibrine respectivement.

Le ciblage spécifique des P-sélectines par les microbulles polymèrse fonctionnalisées avec le fucoïdane a été évalué avec un modèle microfluidique utilisant la biopuce Vena8 Fluoro+.

Les tests de cytotoxicité ont été réalisés à l'aide d'un test de mortalité LDH et d'un test de viabilité MTT sur des cellules HUVEC et des cellules BALB/3T3.

L'évaluation de l'hémolyse a été effectuée sur du sang humain entier provenant de volontaires sains.

Le modèle d'AVC in vivo a été réalisé sur des souris mâles suisses de type sauvage âgées de 6 à 8 semaines. Les têtes des souris ont été stabilisées sur une plate-forme stéréotaxique et un cathéter a été placé dans la veine de la queue pour l'injection du traitement. Après une craniotomie locale au-dessus de l'artère cérébrale moyenne (ACM), la dure-mère a été excisée pour exposer la bifurcation de l'ACM. Une injection pneumatique précise de 1 µl de thrombine murine (1 UI) a été effectuée par des capillaires de verre allongés dans l'ACM pour induire la formation d'un thrombus riche en fibrine. Les procédures de traitement ont été effectuées par voie intraveineuse, 30 minutes après l'injection de thrombine.

Imagerie Speckle : La surveillance de la perfusion cérébrale in vivo a été obtenue à l'aide d'un imageur laser à contraste de chatoiement, ce qui a permis de visualiser les éléments figuratifs du sang.

IRM et perméabilité de la BHE : 24 heures après le traitement, le cerveau des souris a été imagé par IRM pour mesurer la taille des zones infarcies. Pour l'évaluation de la perméabilité de la BHE, de l'acide gadotérique a été injecté par voie intraveineuse dans la veine de la queue et, après 15 minutes, une acquisition T1 Flash tridimensionnelle a été enregistrée.

Biodistribution de la fluorescence ex vivo sur des organes complets ou sectionnés : La biodistribution des microbulles a été mesurée par imagerie de fluorescence dans le proche infrarouge et les organes ont été prélevés 24 heures après le traitement.

Dans le cadre du projet FightClot, nous avons développé des microbulles sensibles aux ultrasons pour le traitement ciblé des accidents vasculaires cérébraux. La synthèse par cavitation acoustique a été optimisée pour la production de MBs polymères ciblés, décrits pour la première fois ici. Ce protocole innovant a permis de diviser par trois le temps de production par rapport à la cavitation hydrodynamique standard. Les propriétés physicochimiques et la biocompatibilité ont fait l'objet d'une évaluation intensive pour conclure à l'amélioration du contraste avec le signal ultrasonore, au ciblage efficace des P-sélectines et au potentiel fibrinolytique. L'évaluation in vivo sur un modèle d'accident vasculaire cérébral chez la souris a démontré l'efficacité des microbulles fonctionnalisées chargées avec du rtPA par rapport à l'injection systémique clinique du médicament. En effet, nous avons observé une réduction du volume de la lésion cérébrale de plus de 50 % avec une dose de rtPA inférieure de 1/10e à celle recommandée chez la souris. Aucune perméabilité de la barrière hémato-encéphalique ou complication hémorragique n'a été observée et la biodistribution attendue a été trouvée dans les organes de détoxification, y compris les poumons et le foie, ce qui indique un potentiel élevé pour un traitement sûr et évolutif. Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour l'application de microbulles ciblantes chargées de médicaments dans le traitement des accidents vasculaires cérébraux ischémiques.

Les principales perspectives du projet FightClot reposent désormais sur la propriété de réactivité des microbulles aux ultrasons. La mémoire ischémique observée après 24 heures sur la région de l'accident vasculaire cérébral avec une fluorescence résiduelle sur l'endothélium activé, nous a permis de réfléchir au potentiel des microbulles fonctionnalisées pour l'imagerie moléculaire. Nous avons démontré la capacité d'amélioration du contraste des microbulles pour le signal ultrasonore et l'imagerie ciblée par ultrasons est un domaine de recherche actif. En effet, la technologie ultrasonore est une méthode non invasive, sûre pour les patientes enceintes et moins coûteuse que d'autres modalités d'imagerie. Avec les récents progrès de l'imagerie ultrasonore de l'AVC chez le rat, les microbulles ciblant la P-sélectine offrent de nouvelles possibilités pour le diagnostic précoce et le suivi de la résolution des caillots dans les accidents vasculaires cérébraux. Par ailleurs, la thrombolyse chimique seule ne donne de bons résultats que pour 40 % des patients et la migration du caillot peut entraîner une série de problèmes graves, notamment l'obstruction des vaisseaux distaux. La nécessité d'un traitement non invasif pour endommager le caillot a conduit la communauté scientifique à étudier l'éclatement du caillot par microbulles aux États-Unis : la sonothrombolyse. D'autant plus que le traitement par le plasminogène tissulaire est moins efficace sur les occlusions distales, la sonothrombolyse pourrait désagréger mécaniquement le caillot en plus de la fibrinolyse. Bien qu'il s'agisse d'un domaine de recherche actif, ces thérapies ne sont pas encore largement disponibles ni totalement comprises. Quelques limites sont néanmoins déjà établies, notamment le seuil de l'indice mécanique de 1,9 et la nécessité d'utiliser des microbulles biocompatibles. Notre technologie est donc un excellent candidat pour le développement de la sonothrombolyse ciblée pour la résolution des accidents vasculaires cérébraux.

Une partie des résultats issus du projet FightClot a été valorisée par 2 présentations orales et 1 poster lors de congrès internationaux (SFNano, BioMARKERS of the Future, ESB) et l’obtention de 2 prix (Meilleure présentation orale et 4ème prix du concours jeunes chercheurs).
Enfin, le projet d’invention concernant les microbulles polymères fonctionnalisées échogènes qui faisait l'objet d'une déclaration d'intention en cours d’évaluation auprès d’Inserm-Transfert a été accepté et une demande de brevet international (PCT/FR2022/050309) a été déposée en février 2022.

Depuis les années 90, l’activateur recombinant du plasminogène tissulaire (rt-PA) est le médicament le plus efficace et le seul approuvé en clinique pour la recanalisation des vaisseaux lors d’événements thrombotiques aigus. Cependant, en raison de sa courte demi-vie, de fortes doses sont nécessaires générant une cascade d’événements entraînant des effets indésirables graves : modulation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et hémorragies intracrâniennes. Le nombre de patients traiter par rt-PA est très limité suite à ces restrictions liées à la sécurité. On estime que moins de 5% des patients reçoivent un traitement par rt-PA et que 60% d'entre eux souffrent d'une invalidité permanente ou meurent d’un AVC aigu. Il existe donc toujours un besoin urgent de traitements sûrs et non invasifs.
Le développement de nouvelles formulations de thrombolytiques suscite de plus en plus d'intérêt pour ouvrir de nouvelles perspectives au traitement thrombolytique clinique afin de de réduire la dose et donc les effets indésirables. Outre le développement de nouveaux agents fibrinolytiques, une stratégie prometteuse basée sur la nanomédecine est proposé ici. FightClot a pour objectif de développer des dispositifs médicaux innovants pour la visualisation et le traitement ciblé des maladies thrombotiques et en particulier des AVC.
Le Partenaire 1 (INSERM U1148) a démontré que le fucoïdane, un polysaccharide marin abondant et peu coûteux doté de chaînes sulfatées, présente une forte affinité pour la P-sélectine, surexprimée à la surface des cellules endothéliales et des plaquettes activées lors de maladies thrombotiques. Il a aussi mis au point des micro- et nanotransporteurs fonctionnalisés avec du fucoïdane et chargés de rt-PA pour le diagnostic moléculaire et la thérapie ciblée in vivo de maladies cardiovasculaires.
Pour promouvoir le traitement ciblé des maladies thrombotiques, le Partenaire 1 synthétisera des microbulles polymères fonctionnalisées échogènes et chargées avec le nouveau médicament fibrinolytique produit par le Partenaire 2 et pouvant être visualisées et détruites (sonoporation) par les séquences ultrasonores ultra-rapides développées par le Partenaire 3 (UMR 7371).
Pour répondre aux restrictions liées à la sécurité d’utilisation du rt-PA, le Partenaire 2 (INSERM U1237) développera un nouveau médicament fibrinolytique en produisant un double mutant original d'activateur du plasminogène tissulaire humain présentant une activité fibrinolytique similaire à celle du t-PA mais sans neurotoxicité, et qui sera chargé sur les microbulles.
Pour améliorer la thrombolyse, le Partner 3, qui possède une grande expérience en imagerie ultrasonore fonctionnelle et vasculaire haute résolution ainsi qu’en délivrance de médicaments par ultrasons, a développé deux techniques permettant de mettre en évidence les microbulles i) les microbulles en écoulement peuvent être séparées des tissus avec les filtres temporels, technique utilisée pour la microscopie de localisation ultrasonore du cerveau, ii) des microbulles fixes ou ciblées peuvent être séparées en utilisant une imagerie à modulation radiale ultra-rapide.
Enfin, pour valider l’efficacité thrombolytique des microbulles échogènes fonctionnalisées, le Partenaire 2 utilisera deux modèles d’AVC précliniques chez des souris présentant une formation de caillots in situ, imitant les principales étiologies de l’AVC ischémique en clinique. L'un réalisé par application locale de FeCl3 pour induire des caillots riches en plaquettes et résistant au tPA, l'autre par infusion locale de thrombine pour générer des caillots riches en fibrine et sensibles au tPA.
FightClot est un projet innovant sur le diagnostic moléculaire et le traitement ciblé des maladies thrombotiques pour répondre au besoin médical non satisfait du traitement des événements cliniques aigus.
Grâce aux résultats préliminaires obtenus par les Partenaires, le projet FightClot devrait atteindre les objectifs proposés à l’ANR.