Traitement ciblé des maladies thrombotiques – FightClot

Pour répondre aux restrictions liées à la sécurité de l'utilisation clinique du rt-PA, nous développerons de nouveaux médicaments fibrinolytiques avec la production d'un double mutant original d'activateurs tissulaires du plasminogène humain présentant une activité fibrinolytique similaire à celle du t-PA mais sans neurotoxicité, qui sera chargé sur des microbulles. Ces microbulles seront activées uniquement au niveau du thrombus par des impulsions ultrasonores focalisées.
Nous avons précédemment démontré que le fucoidane, un polysaccharide marin à chaînes sulfatées, présente une forte affinité pour la P-sélectine in vitro et in vivo qui est surexprimée à la surface des cellules endothéliales et des plaquettes activées au cours des maladies thrombotiques. De plus, nous avons déjà développé des micro et nanosystèmes fonctionnalisés avec du fucoidane et chargés de rt-PA pour réaliser le diagnostic moléculaire et la thérapie ciblée in vitro et in vivo des maladies cardiovasculaires. Ainsi, pour promouvoir le traitement ciblé des maladies thrombotiques, nous synthétiserons, grâce à une méthode originale de cavitation acoustique en émulsion, des microbulles polymériques fonctionnalisées échogènes chargées de thrombolytiques et pouvant être visualisées et détruites (sonoporation) par les séquences ultrasonores ultrarapides que nous développerons spécifiquement.
Le diagnostic moléculaire et la sonoporation des microbulles se feront grâce au développement de nouvelles séquences ultrasonores. L'objectif est de pallier les limites actuelles de l'imagerie à haute fréquence, exploitée pour le rat et la souris, qui souffre de difficultés à distinguer les agents de contraste par rapport aux tissus. Ceci est dû aux oscillations amorties et aux échos non linéaires générés par les microbulles à des fréquences au-delà de leur résonance. Nous avons développé deux techniques pour mettre en évidence les microbulles : 1- Les microbulles peuvent être séparées des tissus à l'aide de filtres spatio-temporels, une technique utilisée pour la microscopie ultrasonore de localisation du cerveau ; 2- Les microbulles ciblées peuvent être séparées en utilisant l'imagerie ultrarapide à modulation radiale. Ainsi, nous avons pu éliminer une grande partie du signal de contamination des tissus et mettre en évidence uniquement les microbulles stables.
Enfin, pour valider l'efficacité de la thrombolyse des microbulles, nous utiliserons un modèle préclinique d’AVC chez la souris avec formation in situ de caillots qui imitent les principales étiologies de l'accident ischémique cérébral en clinique. Ce modèle est réalisé par infusion locale de thrombine pour générer des caillots riches en fibrine. Ainsi, nous serons en mesure de tester les microbulles afin de découvrir leur capacité à restaurer le flux sanguin cérébral. Avec le modèle de thrombine, nous supposons que les microbulles fonctionnalisées induiront une thrombolyse plus rapide et donc moins d'effets secondaires sur le cerveau.

Le partenaire INSERM U1237 - PHIND a montré au cours de ces dernières années que la molécule thrombolytique de référence, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), possède des effets délétères en partie liés à son interaction avec le récepteur glutamatergique NMDA. Ainsi, il a mis au point une forme optimisée du tPA par mutagénèse dirigée. Les mutations ont comme objectifs de maintenir le tPA sous sa forme simple chaine (anti-apoptotique et stabilisateur de la Barrière Hémato Encéphalique) et d’inhiber l’interaction tPA/NMDAR réduisant l’effet neurotoxique. Ce tPA optimisé sans neurotoxicité est maintenant disponible, conformément au diagramme de Gantt prévu initialement, pour la suite du projet ANR FightClot.

Le Partenaire INSERM U1148 – LVTS a mis au point une méthode originale pour obtenir par cavitation acoustique en émulsion des microbulles polymères fonctionnalisées échogènes. Cette méthode permet d’avoir un meilleur rendement de production, une meilleure reproductibilité, une distribution de taille plus centrée sur 3 micromètres de diamètre ainsi que des bulles avec une forme plus sphérique. Les bulles sont stables en suspension plus d’un mois. La méthode développée permet de fonctionnaliser les microbulles avec le fucoidane en surface autorisant le ciblage de la P-Sélectine à la surface des cellules endothéliales et des plaquettes activées. De plus, la présence de ce polysaccharide anionique à la surface des microbulles permet le chargement des thrombolytiques par simple adsorption sans perdre leur activité enzymatique. Enfin, le chargement des thrombolytiques à la surface des microbulles est stable plus de 4 jours en suspension.

Les microbulles de fucoidane ont été comparées, par le Partenaire UMR 7371 – LIB, à des agents de contraste conventionnels dans une configuration in vitro sur les aspects suivants : Echogénicité, non-linéarité et perturbabilité. Les microbulles de fucoidane sont suffisamment échogènes et peuvent être perturbées dans les normes d'imagerie ultrasonore.
Un transducteur ultrasonore dédié à la perturbation a été conçu et testé in vitro. Il a été démontré que les microbulles de fucoidane sont détruites dans des expériences contrôlées. Ce transducteur sera testé in vivo début juillet 2022 chez le Partenaire INSERM U1237 - PHIND.
Enfin, le Partenaire UMR 7371 – LIB a décidé de passer à l'ULM 3D (Microscopie par Localisation Ultrasonore 3D) pour l'imagerie in vivo des microbulles de fucoidane. Le système est actuellement testé in vivo avec des agents de contraste conventionnels par le Post-Doctorant Georges Chabbouh.

Au cours des 28 mois restants du projet FightClot, nous allons finir de valider les propriétés in vitro des microbulles développées en étudiant notamment leur capacité à se lier à des agrégats plaquettaires en flux et quantifier leur cytotoxicité. Nous allons également démarrer leurs évaluations in vivo au travers de leur biodistribution tissulaire par scintigraphie, leur visualisation par échographie ultrarapide et leur efficacité thrombolytique sur des modèles murin d’AVC et de thrombose de la veine cave inférieure.

Une partie des résultats issus du projet FightClot a été valorisée par 2 présentations orales et 1 poster lors de congrès internationaux (SFNano, BioMARKERS of the Future, ESB) et l’obtention de 2 prix (Meilleure présentation orale et 4ème prix du concours jeunes chercheurs).
Enfin, le projet d’invention concernant les microbulles polymères fonctionnalisées échogènes qui faisait l'objet d'une déclaration d'intention en cours d’évaluation auprès d’Inserm-Transfert a été accepté et une demande de brevet international (PCT/FR2022/050309) a été déposée en février 2022.

Depuis les années 90, l’activateur recombinant du plasminogène tissulaire (rt-PA) est le médicament le plus efficace et le seul approuvé en clinique pour la recanalisation des vaisseaux lors d’événements thrombotiques aigus. Cependant, en raison de sa courte demi-vie, de fortes doses sont nécessaires générant une cascade d’événements entraînant des effets indésirables graves : modulation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et hémorragies intracrâniennes. Le nombre de patients traiter par rt-PA est très limité suite à ces restrictions liées à la sécurité. On estime que moins de 5% des patients reçoivent un traitement par rt-PA et que 60% d'entre eux souffrent d'une invalidité permanente ou meurent d’un AVC aigu. Il existe donc toujours un besoin urgent de traitements sûrs et non invasifs.
Le développement de nouvelles formulations de thrombolytiques suscite de plus en plus d'intérêt pour ouvrir de nouvelles perspectives au traitement thrombolytique clinique afin de de réduire la dose et donc les effets indésirables. Outre le développement de nouveaux agents fibrinolytiques, une stratégie prometteuse basée sur la nanomédecine est proposé ici. FightClot a pour objectif de développer des dispositifs médicaux innovants pour la visualisation et le traitement ciblé des maladies thrombotiques et en particulier des AVC.
Le Partenaire 1 (INSERM U1148) a démontré que le fucoïdane, un polysaccharide marin abondant et peu coûteux doté de chaînes sulfatées, présente une forte affinité pour la P-sélectine, surexprimée à la surface des cellules endothéliales et des plaquettes activées lors de maladies thrombotiques. Il a aussi mis au point des micro- et nanotransporteurs fonctionnalisés avec du fucoïdane et chargés de rt-PA pour le diagnostic moléculaire et la thérapie ciblée in vivo de maladies cardiovasculaires.
Pour promouvoir le traitement ciblé des maladies thrombotiques, le Partenaire 1 synthétisera des microbulles polymères fonctionnalisées échogènes et chargées avec le nouveau médicament fibrinolytique produit par le Partenaire 2 et pouvant être visualisées et détruites (sonoporation) par les séquences ultrasonores ultra-rapides développées par le Partenaire 3 (UMR 7371).
Pour répondre aux restrictions liées à la sécurité d’utilisation du rt-PA, le Partenaire 2 (INSERM U1237) développera un nouveau médicament fibrinolytique en produisant un double mutant original d'activateur du plasminogène tissulaire humain présentant une activité fibrinolytique similaire à celle du t-PA mais sans neurotoxicité, et qui sera chargé sur les microbulles.
Pour améliorer la thrombolyse, le Partner 3, qui possède une grande expérience en imagerie ultrasonore fonctionnelle et vasculaire haute résolution ainsi qu’en délivrance de médicaments par ultrasons, a développé deux techniques permettant de mettre en évidence les microbulles i) les microbulles en écoulement peuvent être séparées des tissus avec les filtres temporels, technique utilisée pour la microscopie de localisation ultrasonore du cerveau, ii) des microbulles fixes ou ciblées peuvent être séparées en utilisant une imagerie à modulation radiale ultra-rapide.
Enfin, pour valider l’efficacité thrombolytique des microbulles échogènes fonctionnalisées, le Partenaire 2 utilisera deux modèles d’AVC précliniques chez des souris présentant une formation de caillots in situ, imitant les principales étiologies de l’AVC ischémique en clinique. L'un réalisé par application locale de FeCl3 pour induire des caillots riches en plaquettes et résistant au tPA, l'autre par infusion locale de thrombine pour générer des caillots riches en fibrine et sensibles au tPA.
FightClot est un projet innovant sur le diagnostic moléculaire et le traitement ciblé des maladies thrombotiques pour répondre au besoin médical non satisfait du traitement des événements cliniques aigus.
Grâce aux résultats préliminaires obtenus par les Partenaires, le projet FightClot devrait atteindre les objectifs proposés à l’ANR.