Une nouvelle technologie pour l’antibiogramme rapide – DAMOCLES

Les souches bactériennes étaient issues du laboratoire de Bactériologie-Virologie-Hygiène du CHU de Limoges. Les antibiotiques testés (amoxicilline, amoxicilline-acide clavulanique, céfotaxime, gentamicine, ciprofloxacine et triméthoprime-sulfaméthoxazole) ont été utilisés aux concentrations critiques déterminées par l’EUCAST/CA-SFM. Une suspension bactérienne calibrée a été incubée en l'absence ou en présence d'antibiotique pendant 2h à 37°C. Une fraction de la suspension bactérienne a été injectée dans la machine de SdFFF et des fractogrammes ont été obtenus.

Le fractogramme représente la variation instantanée de quantité des espèces bactériennes en fonction du temps de rétention. Il se compose de deux pics: le premier correspond au volume mort, le second correspond au pic de la population microbienne. Un facteur de rétention a été utilisé pour déterminer les vitesses moyennes des populations bactériennes « traitées » et « non traitées ». Deux paramètres ont été évalués pour quantifier la variation des signaux : le pourcentage de variation du facteur de rétention (PΔR) et le pourcentage de variation de l’aire sous la courbe (PΔAUC). L'analyse comparative des fractogrammes « traitées » et « non traitées » a été réalisée à l’aide de la valeur seuil de significativité, déterminé par courbe ROC. Si la valeur de P∆R et/ou du P∆AUC était inférieure au seuil de significativité, alors la bactérie était considérée comme résistante. Si la valeur du P∆R et/ou du P∆AUC était supérieure au seuil, alors la bactérie était considérée comme sensible.

Pour toutes les souches, une catégorisation clinique (sensible ou résistante) a été effectuée. Ces résultats ont été comparés à ceux obtenus avec la méthode de référence de microdilution en milieu liquide (Sensititre, Thermo Fisher Scientific) et les erreurs ont été définies comme suit : erreurs majeures (ME), les souches étaient résistantes par SdFFF et sensibles par la méthode de référence ; erreurs très majeures (VME), les souches étaient sensibles par SdFFF et résistantes par la méthode de référence. L'accord de catégorie (AC), la sensibilité (Se) et la spécificité (Sp) ont été calculées selon la norme ISO 20776-2. Tout résultat discordant, quel que soit le type d'erreur associé, a été répété et si les résultats du test initial et du test répété n'étaient pas les mêmes, le résultat du test répété a été utilisé pour l'analyse des données.

Une fois les conditions pré-analytiques et analytiques validées, une étude des performances de la technologie de SdFFF a été réalisée, afin d’évaluer la répétabilité et la reproductibilité des résultats. Dans cette étude, quatre isolats issus de trois espèces bactériennes couramment rencontrées dans les infections et identifiées comme pathogènes prioritaires par l’OMS en terme d’antibiorésistance (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa) ont été testées de manière répétée avec deux panels d'antibiotiques. Les résultats de cette étude ont montré une concordance parfaite de 100 % entre les antibiogrammes produits par la méthode SdFFF et ceux obtenus par la méthode de référence, démontrant la capacité de la SdFFF à détecter avec précision les changements morphologiques provoqués par divers antibiotiques chez différentes bactéries, en moins de 3 heures et de s'assurer de la robustesse de la méthode. Ces résultats ont fait l’objet d’un article scientifique publié dans la revue Analytical Chemistry en 2023 (Sedimentation Field-Flow Fractionation: a diagnostic tool for rapid antimicrobial susceptibility testing ; DOI : 10.1021/acs.analchem.3c03134).

De plus, une validation des performances cliniques a été réalisée sur un panel large de souches cliniques de E. coli (100 souches) et de K. pneumoniae (50 souches), avec sept antibiotiques (amoxicilline, amoxicilline-acide clavulanique, pipéracilline-tazobactam, céfotaxime, gentamicine, ciprofloxacine, triméthoprime-sulfaméthoxazole). Cette étude a permis la mise au point d’algorithmes décisionnels pour la catégorisation clinique des souches analysées en SdFFF comme sensibles ou résistantes. L’analyse des 149 souches d’entérobactérales a montré de très bons résultats avec la méthode de référence avec un accord de catégorie (AC) de 98,6 %, une sensibilité (Se) de 98,0 % et une spécificité (Sp) de 99,0 %. Une partie de ces résultats a fait l’objet d’un article scientifique publié dans le Journal of Antimicrobial Chemotherapy en 2024 (Sedimentation field-flow fractionation for rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing: a pilot study; DOI : 10.1093/jac/dkae132).

Une deuxième étude de performance a été menée avec un panel de 6 antibiotiques spécifiques aux infections urinaires (amoxicilline, amoxicilline-acide clavulanique, mécillinam, céfixime, témocilline, fosfomycine, nitrofurantoïne). Les résultats préliminaires sont très encourageants avec un AC de 97,3 %, une Se de 96,2 % et une Sp de 97,6 %. Nous avons également développé et mis en place un protocole afin de réaliser l’antibiogramme directement à partir de flacons d’hémocultures positifs. Pour cette étude, 50 souches de E. coli et 5 antibiotiques d’intérêt clinique (amoxicilline, céfotaxime, gentamicine, ciprofloxacine, triméthoprime-sulfaméthoxazole) ont été testés. Les résultats de cette étude sont prometteurs avec une Se de 98,2 %, une spécificité de100 % et un AC 99,6 %.

Les résultats obtenus ouvrent un grand champ de perspectives. Tout d’abord, il sera important d’évaluer la performance de la SdFFF à réaliser des antibiogrammes rapides en utilisant d'autres espèces bactériennes et différentes familles d'antibiotiques, ceci permettra de tester la robustesse et l'universalité de la technologie SdFFF. De plus, il sera intéressant de poursuivre le travail initié pour les hémocultures et mettre au point des antibiogrammes rapides à partir d’urines directement. Enfin, il sera intéressant de tester plusieurs types d’échantillons humains ou d’origine animale (exemple : lait de mammite). A rajouter bien sûr la perspective développementale de la start-up DAMOCLES Diagnostics.

L'augmentation de la résistance aux antimicrobiens est un problème majeur de santé publique. Ce problème, qui concerne principalement les bactéries à Gram négatif (GNB), se rencontre aussi bien chez l'homme que chez l'animal et dans l'environnement. Face à cette augmentation globale des niveaux de résistance aux antibiotiques, le clinicien qui soupçonne une infection bactérienne doit instituer une antibiothérapie dite probabiliste en attendant les résultats microbiologiques obtenus dans les 36 à 48 heures. Il doit donc choisir entre une antibiothérapie à large spectre susceptible d'être efficace dans le traitement de l'infection mais avec pour effet secondaire d'exercer une forte pression de sélection antibiotique, et une antibiothérapie plus étroite mais au risque d'être inefficace dans le traitement de l'infection de son patient. Face à ce dilemme, des recherches sont en cours dans le but de réduire les délais d'obtention des tests de sensibilité aux antimicrobiens (antibiogrammes) et ainsi de permettre au clinicien de mettre en place plus rapidement une antibiothérapie ciblée et adaptée. C'est dans ce contexte que se situe notre projet.

L'objectif du projet DAMOCLES est d'utiliser une technologie innovante pour réduire le temps nécessaire à l'obtention d'un AST pour adapter l'antibiothérapie en moins de 24 heures. Une étude préliminaire menée sur des souches d'Escherichia coli avec différents antibiotiques a montré que cette technologie peut détecter l'effet de l'antibiotique après seulement 2 heures d'incubation. Cette étude préliminaire a permis le dépôt d’un brevet début avril 2020.

Le projet DAMOCLES vise à étendre cette étude préliminaire à un large panel d'espèces bactériennes et d'antibiotiques, ce qui définira la portée du test. Après une période de validation en laboratoire de recherche, il est prévu d’implanter la technologie dans un laboratoire de bactériologie médicale et de réaliser des tests sur des souches bactériennes de routine.

En raison de la nature universelle de l’antibiogramme, ce projet a un grand potentiel de développement industriel. A noter que dans le même temps, le projet DAMOCLES s'appuiera sur la création d'une spin-off dédiée au développement de nouveaux dispositifs spécifiquement conçus pour le diagnostic médical en bactériologie (marquage CE, dispositif médical).