Matrice extracellulaire dans la maladie cardiaque: des polysaccarides pour réparer le coeur – EXCALYBUR

Un processus intégré de synthèse, de colonisation cellulaire et de purification au scCO2

Notre méthodologie repose sur trois piliers techniques complémentaires visant à créer un matériau biohybride capable de mimer la niche cellulaire naturelle.

1. Synthèse et microstructuration des supports polysaccharidiques Nous avons formulé des hydrogels à base de pullulane et de dextrane (ratio 75:25), réticulés chimiquement par du trimétaphosphate de sodium (STMP) en conditions alcalines. Pour générer un réseau de pores hautement interconnectés, nous avons optimisé une technique de double lyophilisation (2FD). Cette méthode permet d'obtenir une structure poreuse plus homogène et mécaniquement stable par rapport à une lyophilisation simple. Parmi les cinq formulations testées, nous avons sélectionné le support PuDColl-2FD, dans lequel du collagène de type I est introduit par pompage à pression négative après le premier cycle de lyophilisation pour favoriser l'adhésion cellulaire.

2. Colonisation 3D et dépôt de matrice extracellulaire (MEC) in situ Nous avons ensemencé des fibroblastes murins de manière homogène dans toute l'épaisseur des supports en utilisant une méthode de pression négative. Les cultures ont été maintenues pendant 14 jours, durée identifiée comme le compromis idéal pour maximiser la sécrétion protéique tout en maîtrisant le temps de fabrication. Durant cette période, les cellules ont "décoré" les pores en déposant une matrice riche en collagènes I et IV, fibronectine, laminine et élastine.

3. Décellularisation innovante par CO2 supercritique (scCO2) L'innovation majeure de notre approche réside dans l'utilisation du CO2 supercritique pour éliminer les composants cellulaires tout en préservant la matrice déposée. Nous avons immergé les supports dans une solution à faible concentration de SDS (0,5 %) avant de les soumettre à un cycle de scCO2 à 170 bar et 45 °C pendant 90 minutes. Ce procédé a été comparé à une méthode de décellularisation standard (détergents et enzymes) pour valider sa supériorité en termes de préservation biochimique.

4. Caractérisation physique, mécanique et biologique Nous avons rigoureusement évalué nos supports à chaque étape. Porosité et morphologie : Visualisées par microscopie électronique à balayage (MEB) et imagerie confocale 3D. Propriétés mécaniques : Mesure du module de stockage de cisaillement (G’) par élastographie vibratoire (ElastoSens™) pour garantir une rigidité (1,7 à 3,5 kPa) analogue aux tissus mous humains. Efficacité biologique : Quantification de l'ADN résiduel par dosage PicoGreen et immunomarquage des protéines de la MEC pour confirmer l'intégrité de la "niche" biologique après traitement.

Cette approche intégrée nous a permis d'obtenir un matériau acellulaire de haute pureté (< 1 ng d'ADN / mg) tout en maintenant une densité protéique exceptionnelle au sein de la structure poreuse.

Validation d'un support biohybride biomimétique et performant

Nos travaux ont permis de démontrer la faisabilité et la supériorité d'une stratégie de biofabrication combinant ingénierie des polymères et biologie cellulaire.

1. Propriétés physiques et stabilité mécanique des supports Nous avons validé cinq formulations d'hydrogels, identifiant la technique de double lyophilisation (2FD) comme essentielle pour garantir une porosité homogène et interconnectée au sein de la matrice pullulane-dextrane. Nous avons mesuré un module de stockage (G’) compris entre 1,7 et 3,5 kPa, ce qui place nos supports dans la gamme de rigidité des tissus mous humains. De plus, nos résultats montrent que la méthode 2FD confère une stabilité mécanique indépendante de la température (25 °C vs 37 °C), contrairement aux méthodes de lyophilisation simple.

2. Optimisation de la niche biologique et dépôt de MEC L’évaluation de la culture 3D de fibroblastes a révélé que le revêtement des pores avec du collagène de type I après la première lyophilisation (PuDColl-2FD) est la formulation la plus efficace. Dans ces supports, nous avons observé une excellente adhésion et une prolifération cellulaire, avec 74 % à 84 % des pores colonisés par les cellules. À 14 jours de culture, nous avons confirmé par imagerie confocale que les cellules décorent activement les pores en déposant une matrice extracellulaire (MEC) complète, composée de collagènes I et IV, de fibronectin, de laminine et d’élastine. Ce délai de 14 jours a été identifié comme le compromis optimal entre le temps de fabrication et l'abondance du dépôt protéique.

3. Supériorité de la décellularisation par CO2 supercritique (scCO2) L’innovation majeure de nos résultats réside dans l’efficacité de la décellularisation par scCO2 (170 bar, 45 °C, 90 min). Nous avons atteint des niveaux de pureté exceptionnels, avec moins de 1 ng d'ADN par mg de support, alors que les méthodes chimiques standards laissent environ 55 ng/mg. Surtout, nos analyses d’imagerie et de quantification ont prouvé que le scCO2 préserve l’intégrité biochimique de la matrice déposée, contrairement aux protocoles conventionnels qui entraînent une perte significative de protéines essentielles. Le scCO2 agit non seulement comme un agent de nettoyage puissant, mais semble également exercer un effet protecteur sur la microstructure de la MEC.

En conclusion, nous avons réussi à créer un matériau biohybride "prêt à l'emploi" qui surmonte les limites habituelles des polymères synthétiques (manque de signaux biologiques) et des tissus décellularisés naturels (instabilité mécanique). Cette plateforme polyvalente constitue un outil prometteur pour la régénération de divers tissus humains.

Vers une plateforme universelle pour la médecine régénératrice

Les résultats probants obtenus dans le cadre du projet EXCALYBUR ouvrent des horizons prometteurs pour le développement de substituts biologiques avancés. Nous avons établi une preuve de concept solide montrant qu’il est possible de créer des matériaux biohybrides alliant la précision de l'ingénierie des polymères à la richesse de la biologie cellulaire. Forts de ces acquis, nous envisageons plusieurs axes de développement :

1. Adaptation à la spécificité des tissus cibles L’un des atouts majeurs de notre stratégie est sa versatilité. Nous prévoyons d'adapter cette plateforme à une large gamme d'applications cliniques en modulant les propriétés physico-chimiques du support de base. En utilisant des cellules spécifiques (allogéniques ou autologues) au tissu visé, nous pourrons générer des matrices extracellulaires (MEC) dont la composition protéique correspond précisément à la "niche" biologique de l'organe à réparer.

2. Optimisation de la médecine personnalisée L'approche de matrice déposée par les cellules (CDM) offre un potentiel immense pour les thérapies personnalisées. En utilisant des cellules issues du patient lui-même pour "décorer" nos supports avant la décellularisation, nous pourrions créer des greffons sur mesure, minimisant ainsi les risques de rejet immunitaire tout en offrant un environnement biochimique optimal pour la régénération.

3. Transfert clinique et industrialisation Le passage à une échelle industrielle est facilité par l'efficacité de notre protocole au scCO2. Ce procédé rapide (90 minutes) permet d'obtenir des tissus acellulaires, stériles et exempts de virus, des caractéristiques essentielles pour une application clinique sécurisée. La stabilité mécanique de nos supports "prêts à l'emploi" (off-the-shelf) simplifie leur stockage et leur manipulation par les chirurgiens, ce qui représente un avantage économique et logistique majeur par rapport aux méthodes conventionnelles.

En conclusion, nous sommes convaincus que la stratégie développée dans EXCALYBUR pose les jalons d'une nouvelle génération de dispositifs médicaux bio-inspirés, capables de répondre plus efficacement aux besoins croissants de la chirurgie réparatrice et de pallier le manque de donneurs d'organes.

L’ischémie cardiaque (IC) est restée la plus grande cause de mortalité au monde au cours des 20 dernières années. Suite à l'hypoxie, le cœur subit plusieurs modifications développant une maladie chronique: l'insuffisance cardiaque. Au cours des dernières années, des thérapies alternatives basées sur l’ingénierie tissulaire ont abordé le problème fondamental de la perte de tissu cardiaque. Récemment, l'utilisation de la matrice extracellulaire native (MEC), obtenue par décellularisation des tissus, a suscité l'intérêt des chercheurs et des cliniciens pour la réparation du cœur. Néanmoins, certaines limites liées au nombre réduit de donneurs, au risque d'infection et au déséquilibre physique et chimique au sein d'espèces pouvant altérer la physiologie des tissus et des cellules, doivent être encore surmontés. EXCALYBUR a pour objectif de créer un matériau hybride imitant les caractéristiques physico-chimiques et la composition de la MEC cardiaque afin de servir d’échafaudage bioactif dans un modèle d’IC. Notre hypothèse est que, pour répondre aux exigences du biomatériau pour la réparation du cœur, l'approche la plus adéquate consiste à combiner des matériaux avec des propriétés physico-chimiques et mécaniques contrôlées, avec de la MEC naturellement sécrétée contenant les éléments biochimiques pour la réparation des tissus. Il s'agit d'une approche innovante dans laquelle nous visons à surmonter les limitations des hydrogels de polysaccharides synthétiques et de la MEC native, en combinant les deux concepts dans un matériau biohybride unique. L’originalité du projet repose sur la combinaison d’hydrogels à 100% à base de polysaccharide et d’une méthode de dépôt de MEC par les cellules cardiaques pour recouvrir le matériau. Cela fournira aux cellules cardiaques un environnement optimisé par rapport aux autres approches décrites dans la littérature, dans lesquelles un ou plusieurs composants de la MEC sont incorporés au matériau. En conséquence, la réparation cardiaque après une IC sera favorisée en utilisant directement ces patchs acellulaires ou ces patchs pour la thérapie cellulaire, ce qui entraînera une amélioration de la fonction cardiaque et de la réparation tissulaire. Un défi important consistera à développer une méthode permettant de décellulariser le matériel biohybride après le dépôt de MEC par les cellules. Pour ce faire, nous avons déjà entamé notre collaboration avec le Dr P. Subra- Paternault, DR CNRS avec 30 ans d’expertise dans le domaine des fluides supercritiques. Cette technique a été mise en évidence au cours des dernières années pour pallier les inconvénients des techniques plus classiques de décellularisation à base de détergents. Pour atteindre l'objectif de EXCALIBUR, 3 objectifs particuliers répartis en 6 tâches ont été définis: I. Développement de matériel biohybride T1) Caractérisation de la MEC cardiaque de rat T2) Formulation d'un hydrogel à base de polysaccharide présentant les caractéristiques de la MEC cardiaque T3) Revêtement de l'hydrogel avec de la MEC en utilisant un procédé de fabrication par sécrétion cellulaire II. Décellularisation et stérilisation du matériel biohybride (T4) III. Evaluation du matériel biohybride in vitro et in vivo T5) Chargement du matériau avec des cellules du muscle cardiaque et des cellules vasculaires et évaluation in vitro T6) Evaluation de la réparation du cœur dans un modèle d’IC chez le rat Les résultats attendus à la fin du projet incluent: 1) Une carte bien définie des propriétés physicochimiques les plus pertinentes de la MEC cardiaque et des techniques de caractérisation de ces propriétés. 2) Une méthode pour préparer une MEC de type cardiaque en trois étapes: I) synthèse d'hydrogel, II) revêtement d'hydrogel avec de la MEC sécrétée par les cellules et III) décellularisation. 3) Un matériau hybride qui correspond aux propriétés physicochimiques et biologiques de la MEC native et favorise la régénération dans l’IC.