CE17 - Recherche translationnelle en santé

Stratégie innovante visant à traiter des patients Charcot-Marie-Tooth: screening in vitro de molécules de translecture en utilisant les technologies iPSc et CRISPR-Cas9 – NeurIT

Stratégie innovante pour traiter les patients atteints de Charcot-Marie-Tooth : Molécules de translecture, Ciseaux moléculaires CRISPR-Cas9 et Cellules Souches induites à la Pluripotence iPSc

Stratégie innovante pour traiter les patients atteints de Charcot-Marie-Tooth basée sur l’étude in vitro de molécules de translecture sur des modèles de motoneurones issus de cellules souches induites à la pluripotence et modifiés par la technologie des ciseaux moléculaires CRISPR-Cas9

Maladie de Charcot-Marie-Tooth, neuropathie périphérique la plus fréquente chez l’humain : Création de modèles cellulaires innovants et tests de molécules thérapeutiques de type translecture

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente chez l’Homme (1 personne sur 2500). Plus de 90 gènes CMT sont connus, à ce jour. Pour plus de 40% d’entre eux, des mutations de type Codon Stop Prématuré (PTC) sont responsables de l’atteinte des patients. Ces mutations PTC conduisent à la production de protéines tronquées et/ou une diminution du niveau d'ARN en raison du mécanisme de dégradation de l'ARNm non médié (NMD). Le NMD est un mécanisme de surveillance qui doit empêcher la synthèse de protéines tronquées en dégradant les ARNm contenant des codons de terminaison prématurée. Notre objectif principal est de développer des approches thérapeutiques efficaces pour traiter les patients atteints de CMT porteurs de mutations PTC. <br />Nos hypothèses de recherche sont que les mutations PTC pourraient être cachées par certaines molécules thérapeutiques dans les neurones, permettant alors aux ribosomes de traduire complètement les ARNm mutés. De telles molécules sont déjà connues (Gentamycine ou Ataluren par exemple), mais elles entraînent des effets secondaires sur les patients et/ou ont une faible efficacité. En 2017, le Dr F. Lejeune, notre partenaire lillois, a commencé l’identification de nouvelles molécules qui semblent être très efficaces sur les PTC. Nous pensons que ces molécules pourraient être utilisées pour traiter les patients atteints de CMT porteurs de mutations PTC. Afin d’atteindre notre objectif thérapeutique, nous devons, dans un premier temps, atteindre plusieurs objectifs intermédiaires : <br />- Objectif 1 : Tout d'abord, nous devons tester ces molécules sur des modèles cellulaires, facilement cultivables, afin d'évaluer les conditions optimales pour les utiliser (concentration, optimisation des combinaisons de molécules, etc ...). <br />- Objectif 2 : Par ailleurs, à partir d'iPSc, nous devons créer et caractériser in vitro des motoneurones mimant les motoneurones des patients atteints en utilisant des biopsies directes de peau ou la stratégie CRISPR-Cas9 en collaboration avec nos partenaires bordelais. <br />- Objectif 3 : Ensuite, nous étudierons si les nouvelles molécules identifiées par nos partenaires de Pasteur Lille, sont efficaces sur ces motoneurones générés.<br />Nous concentrons actuellement nos efforts sur deux gènes impliqués dans la CMT : GDAP1 et SH3TC2

Concernant les molécules thérapeutiques, nos collaborateurs lillois de l’équipe INSERM U1277 – Institut Pasteur ont accès à une chimiothèque de 10 000 molécules. Les tests seront réalisés sur des modèles cellulaires facilement cultivables de type Hela transfectés avec des plasmides rapporteurs contenant un ADNc codant la luciferase firefly interrompu par un intron et un codon PTC pour cibler les ARNs soumis au NMD. Concernant les modèles cellulaires, l’équipe coordinatrice UR20218-NeurIT (Limoges) maîtrise la création de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSc), à partir de fibroblastes dermiques, et leur différenciation en motoneurones (MN) (cellules affectées chez les patients CMT), fournissant ainsi un excellent modèle in vitro pour tester des molécules thérapeutiques. A ce jour, nous avons réalisé ce protocole pour trois individus contrôles et un individu porteur de mutations homozygotes PTC sur le gène GDAP1. Afin d’élargir notre étude, nous avons souhaité générer de nouveaux modèles en créant de nouvelles mutations PTC sur le gène GDAP1, mais également en créant des mutations PTC sur un autre gène responsable du CMT. Nous avons choisi le gène SH3TC2, responsable d’une forme sévère et précoce de CMT, qui présente au moins un allèle avec mutation PTC chez 88% des patients. En collaboration avec le laboratoire INSERM1218 (Bordeaux), expert de la technologie « CRISPR-Cas9 », des mutations propres et durables du gène GDAP1 et SH3TC2 seront créées au sein des cellules iPS de nos individus contrôles pour ensuite les différencier vers la lignée neuronale. Ces modèles seront ensuite utilisés pour tester les molécules thérapeutiques identifiées par nos collaborateurs lillois.

A partir d'une chimiothèque de 10 000 molécules, l'équipe lilloise a déjà testé 6 000 molécules et identifié 30 molécules intéressantes présentant des activités de translecture des PTC et/ou d'inhibiteur du NMD. Des études complémentaires, comme l'évaluation de la toxicité, ont permis de retenir deux molécules présentant une activité inhibitrice du NMD. Les 4 000 autres molécules supplémentaires sont actuellement à l'étude.
Concernant la création de modèles cellulaires adaptés, nous avons obtenu des cellules iPSc et des motoneurones d'un patient porteur de mutations non-sens homozygotes de GDAP1 (p.Ser194*), mais aussi de trois individus sains. Nous avons caractérisé ce modèle et publié nos résultats dans Biomedicines. Pour résumer nos résultats, nous avons décrit la première étude fonctionnelle de GDAP1 sur des motoneurones dérivés de cellules souches humaines induites (hiPSCs), obtenus à partir de sujets normaux et d'un patient CMT2H, porteur de la mutation homozygote c.581C>G (p.Ser194*) de GDAP1. Au niveau de l'ARNm, nous avons observé que, chez les sujets normaux, GDAP1 est principalement exprimé dans les motoneurones, alors qu'il est drastiquement réduit dans les cellules du patient contenant un codon de terminaison prématurée (PTC), probablement dégradé par le système de désintégration de l'ARNm médié par le non-sens (NMD). Des études morphologiques et fonctionnelles ont révélé dans les motoneurones des patients atteints de CMT une diminution de la viabilité cellulaire associée à un dysfonctionnement des lipides et au développement du stress oxydatif. La mitochondrie est un organite clé dans la génération du stress oxydatif, mais elle est aussi principalement impliquée dans le métabolisme énergétique. Ainsi, dans les motoneurones du patient CMT, des défauts de cristaux mitochondriaux ont été observés, même si aucun déficit de production d'ATP n'est apparu. Ce modèle cellulaire de motoneurones dérivés de hiPSCs souligne le rôle de la mitochondrie et du stress oxydatif dans la maladie CMT et ouvre la voie à l'évaluation de nouveaux traitements.
Il est important de disposer de modèles supplémentaires portant une mutation PTC dans GDAP1, mais aussi dans d'autres gènes tels que SH3TC2. Nous avons prévu de générer ces mutations dans des iPSc provenant d'un de nos patients sains. L'équipe de Bordeaux a réalisé la première étape de ces créations en testant une stratégie CRIPR-Cas9 récente nommée Base-Editing et a réussi à générer la mutation GDAP1-p.Arg191* sur la lignée cellulaire facile à cultiver HEK-293, mais aussi la mutation SH3TC2-p.Arg954*. Nous testons maintenant cette stratégie sur nos cellules iPS de contrôle pour créer ces nouveaux modèles. Cette partie du projet est en cours.

Les prochaines étapes de ce projet seront 1) la création des nouveaux modèles cellulaires adaptés de motoneurones issus de cellules iPSc en utilisant la stratégie CRISPR-Cas9 Base-Editing testée par nos collègues bordelais, 2) le test des molécules de translecture et/ou d’inhibiteurs du NMD identifiés par nos collègues lillois, sur nos modèles cellulaires adaptés. Ces molécules seront testées soit seules, soit en combinaison. A la fin de ce projet, les molécules ayant montré une bonne efficacité sur nos modèles cellulaires et ne présentant pas de toxicité, pourront être testés sur des modèles in vivo et in fine ces molécules pourront être utilisées pour des essais cliniques chez l’Homme. Ce projet met en avant un nouvel espoir de thérapie. Ce projet sera la preuve de concept que ces molécules de translecture et/ou inhibitrice du NMD, sont bien efficaces sur les mutations de type « Codon de Terminaison prématurée (PTC) » dans nos modèles de neuropathies CMT. Cette approche pourra s’appliquer aussi à d’autres maladies neurologiques génétiques, mais également à toutes les maladies génétiques dues à une mutation PTC (mucoviscidose, myopathie, etc …).

Miressi F, Benslimane N, Favreau F, Rassat M, Richard L, Bourthoumieu S, Laroche C, Magy L, Magdelaine C, Sturtz F, Lia AS, Faye PA. GDAP1 Involvement in Mitochondrial Function and Oxidative Stress, Investigated in a Charcot-Marie-Tooth Model of hiPSCs-Derived Motor Neurons. Biomedicines. 2021 Aug 2;9(8):945.

Palma M, Lejeune F. Deciphering the molecular mechanism of stop codon readthrough. Biol Rev Camb Philos Soc. 2021 Feb;96(1):310-329. Review

Lejeune F. Nonsense-Mediated mRNA Decay, a Finely Regulated Mechanism. Biomedicines. 2022 Jan 10;10(1):141. Review

Loret C, Pauset A, Prouzet-Mauleon V, Faye PA, Miressi F, Benslimane N, Sturtz F, Favreau F, Turcq B and Lia AS. CRISPR-Cas9 and iPSCs technologies to create Charcot-Marie-Tooth cellular models. First CRISPR and translational medicine Congress” Bordeaux, March-April 2022. Oral presentation

Miressi F, Benslimane N, Favreau F, Rassat M, Richard L, Bourthoumieu S, Laroche C, Magy L, Magdelaine C, Sturtz F, Lia AS and Faye PA. A hiPS-derived cellular model of motor neurons to investigate impaired mechanisms in GDAP1-associated Charcot-Marie-Tooth disease. Peripheral Nerve Society Annual Meeting, Miami, Mai 2022. Oral presentation

Benslimane N, Miressi F, Favreau F, Loret C, Rassat M, Richard L, Bourthoumieu S, Laroche C, Magy L, Magdelaine C, Sturtz F, Lia AS and Faye PA. GDAP1 involvement in mitochondrial function and the oxidative stress development in a hiPSCs-derived motor neurons model originating from a patient carrying the Charcot-Marie-Tooth disease. French Society for Stem Cell Research, Montpellier, 9-10 sept, 2021. Poster

Benslimane N, Miressi F, Richard L, Bourthoumieu S, Rassat M, Laroche C, Magy L, Magdelaine C, Favreau F, Sturtz F, Faye PA and Lia AS. Modelling Charcot-Marie-Tooth disease with hiPSCs-derived motor neurons model. Peripheral Nerve Society Annual Meeting, Miami, Mai 2022. Poster

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Plus de 90 gènes CMT sont connus. Environ 10% des mutations CMT sont des Codons STOP Prématurés (PTC). Notre objectif est de développer des approches thérapeutiques efficaces pour traiter ces patients porteurs de mutations PTC. L’équipe coordinatrice de Limoges maîtrise la création de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSc) et leur différenciation en motoneurones (cellules affectées chez les patients CMT), fournissant ainsi un excellent modèle in vitro pour tester des molécules thérapeutiques. L’équipe de Bordeaux, experte en technologie CRISPR-Cas9, générera des mutations PTC dans les gènes CMT sur iPSc. L’efficacité des nouvelles molécules de translecture, identifiées par l’équipe lilloise, sera ensuite mesurée sur les motoneurones générés. Ce projet sera également la preuve de concept pour traiter d’autres maladies héréditaires dues aux mutations PTC.

Coordination du projet

Anne-Sophie LIA (Maintenance myélinique et neuropathies périphériques)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

ACTION Actions for onCogenesis understanding and Target identification in ONcology
CANTHER Cancer Heterogeneity, Plasticity and Therapy Resistance
MMNP Maintenance myélinique et neuropathies périphériques

Aide de l'ANR 413 828 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2020 - 42 Mois

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