Enregistrements multi-photonique in vivo du potentiel de membrane dans les circuits inhibiteurs cérébelleux participant à la séparation de patrons – MuVRICC

Durant les précédentes décennies, la contribution des interneurones inhibiteurs sur le contrôle général de l’activité du système nerveux a été étudié intensément, en particulier dans le contexte de la régulation du gain par approche feedback et feedforward et leurs contributions dans la genèse des oscillations. Cependant, le rôle des neurones inhibiteurs sur le traitement précis des informations temporelles et contextuelles telle que la séparation de patrons, reste à être examinée de manière compréhensive. Ceci est due, en partie, aux difficultés techniques d’acquérir des populations ciblées d’interneurones de microcircuits locaux chez l’animal en comportement.
Alors que des enregistrements multicellulaires sont réalisés en routine grâce à l’imagerie calcique, la résolution temporelle et la sensibilité des sondes calciques dans les interneurones est limitante, c’est-à-dire que le transitoire calcique utilisé comme un proxi pour révéler indirectement la survenue très fréquente de potentiels d’action rapides est tout simplement de très petite amplitude et très lent dans ces types de cellule.
Dans ce projet, nous utiliserons des indicateurs de voltage génétiquement encodés (GEVI) pour enregistrer optiquement à la fois les fluctuations du potentiel membranaire et l’activité de décharge de groupes de neurones génétiquement identifiés avec une précision inférieure à la milliseconde. Cette technique pour laquelle nous avons été des pionniers, ouvre une voie pour l’acquisition populationnelle de neurones rares avec une haute rentabilité, ce qui était inaccessible avec les techniques d’électrophysiologie existantes.
Notre projet vise à étudier deux types rares d’interneurones cérébelleux pour lesquels l’activité populationnelle est complétement inconnue chez l’animal en comportement et nous permettra de mettre en lumière des mécanismes tant au niveau cellulaire qu’au niveau des circuits.

Nous effectuerons nos études dans un contexte où le paradigme expérimental est dénué de contraintes artificiels telle que des limites temporelles (déclanchement de stimulus), d’une tâche, de signaux de conditionnement ou de sur-apprentissage. Utilisant ce concept, nous évaluerons les déterminants spatiaux et temporel de l’empreinte de l’inhibition sur les cellules granulaires. Pour éviter la complexité des interactions cortico-cérébelleuses et permettre de réaliser des corrélations directes avec la posture corporelle, nous focaliserons notre étude sur la partie vermale du cervelet, la partie la plus dorsale et accessible qui interagit avec la moëlle épinière et les circuits du tronc cérébral. Grâce à ces outils, nous testerons une nouvelle hypothèse qui est que la séparation de patrons sensori-moteurs survient dans la couche granulaire grâce aux boucles réentrantes et circuits de l’olive inférieure et non pas telle une propriété intrinsèque du circuit principalement feedforward de la couche granulaire tel que précédemment énoncé.

Pour réaliser nos études dans un contexte où le paradigme expérimental est dénué de contraintes artificiels et permettre l’émergence de divers état sensori-moteurs, nous avons continué de développer le paradigme expérimental et réaliser une avancée majeure dans l’analyse de ces différents états. Grâce à une classification non supervisée, nous arrivons à séparer des séquences comportementales qui sont répétables d’une session d’imagerie à l’autre. Cette méthodologie nous permet actuellement de comprendre la signalisation du circuit sous-tendant l’apprentissage supervisé que nous mettrons en parallèle de l’acquisition populationnel de cellule de Golgi.
Afin de réaliser des enregistrements populationnels de cellule de Golgi, nous avons développé et mis au point une stratégie génétique originale qui nous permet de voir 2 à 3 neurones dans le champs de vue. Nous avons également validé un nouvel indicateur de voltage (Cell, in press) qui a des performances pour les cellules du cervelet bien meilleur que la version que nous avons publiée en 2019. De plus, nous avons amélioré la méthode d’excitation optique pour réduire le temps passer par cellule afin de garder la même résolution temporelle quand nous enregistrons plusieurs cellules simultanément. Cette amélioration, nous a permis de gagner en spécificité et la taille du potentiel d’action passe de 17 à 23 %, soit une augmentation de ~20%. Afin de garder le même signal sur bruit entre les enregistrements multicellulaires et cellule unique, nous avons établi une collaboration et sommes en train de valider une nouvelle approche de débruitage qui nous permet de gagner un facteur 3 en termes de rapport signal sur bruit. Grâce à ces avancées, nous avons pu enregistrer récemment différentes paires/triplets de cellules de Golgi et sommes en train d’analyser l’activité de décharge synchrone, l’activité sous-seuil corrélée, ses oscillations et le lien entre ces activités et le comportement.

Les perspectives seront surement nombreuses quand les données du projet seront analysées.

Pas encore réalisé.

Le traitement efficace des informations perçues lors de l’exploration d’environnement complexe implique que les circuits neuronaux doivent séparer les patrons d’activités qui représentent des informations sensori-motrices similaires. La séparation de patrons, qui est un processus cérébral central pour lequel le cervelet semble s’être spécialisé, est préalable à leur classification. Dans le cortex cérébelleux, la séparation des afférences excitatrices (fibres moussues FM) est assurée par des millions de cellules granulaires (CGr) alors que la classification des patrons semble être assurée par les cellules de Purkinje supervisée par une entrée via la fibre grimpante.
Les théories classiques (Marr, 1969) et points de vue actuels (D’Angelo et al., 2013) supposent que la séparation des patrons d’entrées afférentes se déroule en deux étapes: leur recodage grâce à l’expansion combinatoire des CGr suivi par une réduction de l'activité des CGr par le biais d'un contrôle de gain. Les cellules de Golgi (CGo) qui constituent la principale source d'inhibition des CGr fournissent un barrage inhibiteur dépendant des entrées. Cependant, un tel mécanisme ne semble pas être le moyen le plus efficace de séparer les patrons de FM. En effet, la mise en commun d’un contrôle de gain sélectionnerait les CGr connectées aux FM les plus actives, et non les CGr répondant aux patrons les plus saillants dans un contexte particulier. De plus, ce mécanisme ne permet pas de séparer les patrons qui partageraient des entrées FM de niveau d’activité élevée similaire mais qui diffèreraient par d'autres aspects importants suggérant l’existence d’autres mécanismes.
Les CGo ont une anatomie idéale pour implémenter un contrôle de l’excitabilité des CGr et fournir le contraste spatial et temporel requis. Cependant, des propriétés singulières de leurs microcircuits auraient dû être prises en compte pour évaluer complétement leurs fonctions. Il a été montré que la décorrélation des patrons est améliorée par des boucles récurrentes. D’ailleurs, les CGo sont à la croisée de circuits synaptiques qui forment ces boucles, notamment les circuits Purkinje-Lugaro-CGo et cellules inhibitrices nucléo-corticales-CGo qui pourraient désinhiber la couche granulaire le long de l’axe médiolatéral. En revanche, les fibres grimpantes, associées à l’apprentissage supervisé, influencent l’activité des GCo par une transmission à la fois excitatrice et inhibitrice. De plus, l’organisation parasagittale de leurs synchronies pourraient enrichir le processus de séparation de patron selon un axe orthogonal, ce dernier évoluerait donc selon l’apprentissage. Malheureusement, ni les enregistrements de ces circuits, de population de CGo, ni leur influence sur les CGr ont étaient effectué chez l’animal en comportement.
Récemment, nous avons réalisé une première mondiale en enregistrant le potentiel de membrane de plusieurs cellules par acquisition multi-photonique chez l’animal en comportement en combinant l’utilisation d’un indicateur de Voltage génétiquement encodé et la microscopie à accès aléatoire ultra-rapide. Cette technologie révolutionnaire nous donne un accès sans précédent aux enregistrements par paires optiques des membres des circuits présynaptiques des CGo et leurs CGr lors de tâches motrices impliquant des ajustements posturaux.
Nous proposons d’étudier comment et grâce à quelles règles et mécanismes un réseau inhibiteur pourrait sous-tendre une séparation de patron optimisée. De fait, nous testerons l'hypothèse originale selon laquelle les boucles réentrantes qui sont sous l'influence de la sortie du cortex cérébelleux façonnent de manière contextuelle l’activité de CGo individuelles qui sont couplées électriquement.
Notre but est donc de démontrer que la mise en forme spatiale et temporelle des CGr par ces microcircuits vont au-delà des fonctions et circuits canoniques et fournit un substrat pour que les réseaux de neurones réalisent la séparation optimisée des patrons.