Continuer à marcher: maintien de l'innervation musculaire – DevandMaintain

Le projet DEVandMaintain vise à identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui assurent le maintien de l’architecture du système locomoteur, en se concentrant sur le réseau neuromusculaire de la patte adulte de Drosophila melanogaster. Le maintien correct de l’innervation musculaire est essentiel pour préserver la fonction locomotrice.

Un code combinatoire de facteurs de transcription (TFs), exprimés dans les motoneurones (MNs) au cours du développement, détermine leur morphologie spécifique et leur connectivité musculaire. Ces facteurs de transcription morphologiques (mTFs) constituent une véritable matrice génétique de l’architecture du circuit moteur. DEVandMaintain fait l’hypothèse que ce code de mTFs est conservé chez l’adulte afin de maintenir la connectivité spécifique entre les MNs et leurs muscles cibles. Ce projet multi-échelle intègre des analyses allant de la régulation génique à l’architecture des circuits et au comportement, et s’articule autour de trois volets complémentaires :

•WP1 – Déterminer la fonction du code de mTFs dans le maintien de l’innervation musculaire adulte.

Des données préliminaires montrent que plusieurs mTFs, tels que Oli et tj, restent exprimés chez les MNs adultes. Nous développerons des outils génétiques innovants permettant un contrôle temporel de l’inactivation génique et la visualisation simultanée de MNs mutants et sauvages dans un même individu. Ces outils, basés sur les outils CRISPR/Cas9 et LexA/GAL4, permettront une dissection fonctionnelle des mTFs dans les neurones adultes. Nous analyserons comment la perturbation ou la reprogrammation du code de mTFs modifie l’architecture axonale et la connectivité synaptique.

•WP2 – Identifier les gènes effecteurs impliqués dans le maintien de la connectivité neuromusculaire.

Nous établirons des profils d’expression génique dans les différents muscles de la patte adulte à l’aide de la technique TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification), permettant d’isoler les ARNm spécifiques à chaque type musculaire. Les gènes différentiellement exprimés codant des protéines membranaires ou sécrétées seront étudiés comme médiateurs potentiels de la communication MN–muscle. Ces approches mettront en lumière le dialogue moléculaire entre MNs et muscles nécessaire au maintien de l’architecture synaptique.

•WP3 – Évaluer la performance locomotrice lorsque la machinerie de maintenance est altérée.

Nous quantifierons le comportement locomoteur à l’aide du système haute résolution Flywalker, qui mesure les paramètres cinématiques des empreintes et de la démarche. Cette analyse reliera directement les perturbations moléculaires du maintien neuromusculaire aux conséquences comportementales.

Notre objectif est de redéfinir les couples MN–muscle comme des unités développementales dont les programmes génétiques coordonnés garantissent l’intégrité des circuits tout au long de la vie.

Maintien de l’innervation musculaire chez l’adulte:

Nous avons construit un allèle du gène Oli permettant d’induire une mutation de manière contrôlée chez l’adulte à l’aide d’un simple heat shock. Le système mis au point fonctionne : il permet effectivement de convertir un allèle sauvage en allèle mutant, l’un exprimant lexA et l’autre exprimant GAL4. Cependant, cet allèle n’a pas pu être pleinement exploité pour deux raisons: l’expression de lexA était trop faible pour pouvoir suivre les terminaisons nerveuses inervant les muscles, et la mutation entraîne la perte de la régulation post-transcriptionnelle du messager, ce qui change le territoire d’expression de la protéine GAL4, comparé à celle connue et décrite pour le gène Oli.

Nous avons néanmoins démontré l’utilité et la fonctionnalité de la cassette génétique que nous avons construite. Celle-ci est désormais utilisée sur un autre gène cible, DIP-alpha, dont la régulation post-transcriptionnelle est plus simple, ouvrant la voie à de nouvelles études sur le maintien de l’innervation musculaire.

Identification des gènes impliqués dans le maintien de la connectivité neuromusculaire.

Nous avons d’abord évalué la faisabilité de la méthode TRAP dans notre système, avant de nous orienter vers la technologie 10x Genomics afin d’analyser l’expression génique dans les muscles adultes de la patte.

Nous avons ainsi réalisé un séquençage d’ARN sur noyaux isolés (snRNA-seq) à partir des fémurs et tibias d’animaux exprimant des marqueurs fluorescents dans un muscle spécifique. Étant donné que l’environnement musculaire local peut contribuer à la spécificité synaptique, cette approche permet de caractériser la diversité transcriptionnelle des muscles impliqués dans la locomotion.

Les analyses révèlent des signatures transcriptionnelles distinctes entre les quatre muscles fémoraux, suggérant que les mécanismes de maintien synaptique sont à la fois spécifiques à chaque muscle et organisés régionalement. Plusieurs facteurs de transcription et protéines transmembranaires sont différentiellement exprimés, mettant en évidence la nécessité d’explorer plus en détail le protéo-interactome axone-muscle propre à chaque unité motrice.

Dans ce cadre, nous collaborons avec le laboratoire de Richard Mann (Columbia University, New York), qui a établi le profil transcriptionnel des motoneurones adultes. Cette collaboration vise à identifier les paires de gènes spécifiques MN-muscle qui assurent la connectivité sélective entre un motoneurone et son muscle cible, et donc à mieux comprendre les bases moléculaires de la stabilité du réseau neuromusculaire.

Nous esperons ainsi pourvoir identifier les paires de gènes MN-Muscle qui permettent la connection spécificque d’un MN avec son muscle cible.

Le mouvement précis des appendices dépend de connexions neuromusculaires spécifiques, où les motoneurones (MNs) innervent les muscles cibles à travers un connectome axon-muscle défini. Bien que ce connectome soit établi au cours du développement, on ne sait pas comment il est maintenu tout au long de l’âge adulte.

En utilisant la patte de Drosophila melanogaster comme modèle, nous étudierons trois MNs innervant deux muscles distincts (ltm1, ltm2) pour découvrir les mécanismes moléculaires préservant la spécificité de l’innervation musculaire adulte. La drosophile offre un système particulièrement maniable grâce à son organisation neuromusculaire compacte, ses outils génétiques et la conservation des voies moléculaires. Sa structure permet une imagerie haute résolution des unités neuromusculaires entières, ainsi que des études moléculaires, cellulaires et comportementales intégrées.

Nos perspectives sont les suivantes :

•Identifier le réseau génétique soutenant l’innervation adulte.

Nous appliquerons le séquençage d’ARN de cellule unique/noyau (SCS/SNS) et la transcriptomique spatiale (MERFISH) pour cartographier les programmes transcriptionnels des MNs et des noyaux musculaires impliqués dans le maintien de l’innervation. Ces analyses identifieront les protéines transmembranaires co-exprimées et sécrétées qui pourraient coopérer pour maintenir des connexions spécifiques à l’âge adulte. La cartographie spatiale de l’expression des gènes dans les muscles révélera les noyaux sous-synaptiques près des jonctions neuromusculaires, révélant des candidats contrôlant le maintien local de la connectivité. Les gènes candidats seront testés fonctionnellement en manipulant les génes dans les MNs et les muscles pour évaluer leur contribution à la stabilité synaptique et au comportement moteur.

•Déterminer le rôle de DIP-α et de son partenaire musculaire Dpr10 dans le maintien de la spécificité synaptique et de la locomotion.

Nous utiliserons des outils génétiques conditionnels pour visualiser, perturber et sauver la fonction de DIP-α/Dpr10 chez les mouches adultes : nous avons identifié ces protéines comme essentielles pour la connexion MN-muscle sur le muscle fémoral ltm2. En utilisant l’imagerie à haute résolution (microscopie confocale et 3D-STED) et les tests comportementaux (FlyWalker), nous évaluerons comment la manipulation de DIP-α affecte le câblage axonal, la formation des synapses et la performance locomotrice. Les systèmes de knockdown et knockout conditionnel, inductibles par un choc thermique ou sensible à la température GAL80, permettront un contrôle temporel précis pour séparer les fonctions de développement et de maintenance.

Au-delà d’une compréhension fondamentale, cette recherche a des implications biomédicales : DIP-α/Dpr10 font partie de la famille des IgLON, liée chez l’homme aux troubles neurodégénératifs (ex. syndrome anti-IgLON5).

La locomotion est un comportement stéréotypé utilisé par les animaux pour trouver de la nourriture, des partenaires ou pour échapper aux prédateurs. Comme l’a dit Michel de Montaigne: ‘Notre vie n'est que mouvement’. Le patron régulier et précis de la locomotion est directement lié à l'architecture sophistiquée du système locomoteur. Son architecture est construite au cours du développement et maintenue pendant la vie adulte.
Chaque terminaison axonale des motoneurones innerve des fibres musculaires spécifiques et arborise une architecture unique définie par leur forme. Ce câblage unique des axones des motoneurones assure la bonne contraction des muscles permettant ainsi une locomotion correcte. Pendant la vie adulte, le maintien de l’innervation musculaire est essentiel au fonctionnement du système locomoteur. DevandMaintain détermina les mécanismes contrôlant le maintien de l'innervation musculaire en utilisant des approches de profilage d'ARN combinées à des outils génétiques conçus par l’équipe pour abolir la fonction des gènes chez des organismes adultes et visualiser avec une haute résolution les conséquences morphologiques de ces manipulations génétiques sur l'innervation musculaire. De plus, ce projet multi-échelle définira les conséquences sur la locomotion de telles manipulations avec des technologies comportementales uniques. Les connaissances qui seront générées par DevandMaintain influenceront différents domaines de la Biologie car c’est un projet à l’interface de la biologie du développement et de physiologie.