Voies de trafic du canal sodique dans le cardiomyocyte – TRAFFIC

Nous avons utilisé différents modèles cellulaires (cardiomyocytes murins et dérivés des cellules souches pluripotentes induites, hIPS) pour invalider CASK et étudier l’organisation des contacts cellulaires (correspondants aux disques in vitro), au niveau moléculaire et fonctionnel. Une analyse protéomique a également été réalisée pour obtenir une vue complète des voie régulées par CASK. Nous avons ensuite testé le bénéfice de la stratégie d’invalidation de CASK dans modèle in vitro humain d’arythmie caractérisé par la perte des desmosomes. Nous avons utilisé un modèle animal murin pour étudier les effets fonctionnels (fonction pompe et fonction électrique) de la stratégie d’invalidation de CASK. Pour réaliser ce projet, nous avons 1) mis au point les différentes constructions plasmidiques nécessaires à la production des virus nécessaires pour infecter les cellules cardiaques in vitro et in vivo, 2) développé des algorithmes de quantification des contacts, 3) développé des constructions permettant le suivi en temps réel des protéines membranaires, et enfin 4) généré des lignées de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites contrôles et porteuses de mutations.

Nos travaux ont permis de montrer que la déplétion de la protéine CASK 1) favorise la fonction cardiaque in vivo, et 2) favorise in vitro l’organisation des protéines du disque : jonctions électriques et desmosome. Cette stratégie s’avère notamment efficace pour restaurer les jonctions desmosomales dans le contexte de la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. Cette découverte a constitué les bases d’un nouveau projet portant la stratégie de déplétion de CASK dans cette pathologie héréditaire pour laquelle la seule solution thérapeutique actuelle est la transplantation cardiaque.

Preuve de concept de l’efficacité de l’invalidation de CASK pour promouvoir la stabilisation du desmosome dans la cardiomyopathie arythmogène in vitro.
Application potentielle en thérapie génique dans le traitement de la cardiomyopathie arythmogène.

Publication 1: Blandin CE, Dilanian G, Fontaine V, Mougenot N, Gravez B, Bobin P, Duboscq-Bidot L, Farhi D, Chardonnet S, Nadaud S, Sanchez-Alonzo JL, Shevchuk A, Gorelik J, Gandjbakhch E, Hatem SN, Villard E, Balse E.
Depleting trafficking regulator CASK promotes intercalated disc organization and ventricular function, BIORXIV/2024/618172
Publication 2: Blandin CE, Gravez BJ, Hatem SN, Balse E.
Remodeling of Ion Channel Trafficking and Cardiac Arrhythmias. Cells 2021. doi: 10.3390/cells10092417.

Contexte: La localisation et la densité de canaux ioniques présent à la surface des cardiomyocytes (CMs) déterminent l’activité électrique cardiaque. Une désorganisation ou une altération de la fonction de ces canaux conduit à des arythmies cardiaques, souvent fatales. Le courant sodique, porté par les canaux NaV1.5, est responsable de la dépolarisation rapide et de la propagation du potentiel d’action d’un CM à l’autre. Les canaux NaV1.5 sont distribués de façon hétérogène dans la membrane du CM : leur concentration au disque intercalaire et leur faible densité à la membrane latérale est cruciale à la conduction anisotrope (longitudinale>transversale) du front de dépolarisation dans le myocarde. NaV1.5 est positivement régulé par de nombreux partenaires, principalement localisés dans le disque. A l’inverse, nous avons identifié un partenaire original, la protéine CASK, spécifiquement localisé à la membrane latérale et qui régule négativement le canal en empêchant sont trafic antérograde.

Hypothèse de travail et Objectifs: De par sa localisation exclusive à la membrane latérale (notamment les adhésions focales) et sa fonction inhibitrice sur le canal, CASK pourrait jouer un rôle central dans l’organisation structurale et fonctionnelle des CMs et la mise en place de l’anisotropie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les bases moléculaires de l’interaction entre organisation structurale et électrique des CMs.

WP1) Étudier, en temps réel, le trafic et l’adressage de NaV1.5 dans le CM (disque vs membrane latérale). Nous testerons l’hypothèse d’une plateforme de tri lors des stades précoces du trafic qui orienterait l’adressage de NaV1.5 vers ces domaines. Le partenaire 2 a développé un système de rétention utilisant des harpons spécifiques (RUSH) permettant la synchronisation du trafic des protéines d’un compartiment donneur au compartiment final. Le co-trafic de NaV1.5 et de ses partenaires sera étudié dans des CMs adultes en utilisant des approches d’imagerie multi-couleurs.

WP2) Caractériser le rôle de CASK dans l’organisation de la microarchitecture des CMs et l’exocytose localement régulée. L’utilisation de formes tronquées de CASK développées par le partenaire 1 et la technique de RUSH développée par le partenaire 2 permettra d’étudier en temps réel le trafic du canal dans le CM et la dynamique du canal dans le plan membranaire par microscopie TIRF. Des approches d’imagerie 3D seront utilisées pour étudier l’organisation du cytosquelette et des adhésions focales dans les CMs après modulation de l’expression de CASK. Une approche agnostique reposant sur une analyse protéomique sera conduite pour déterminer de nouvelles voies régulées par CASK.

WP3) Étudier le rôle de CASK dans la mise en place et le maintien de la polarité structurale et l’anisotropie. Deux conditions caractérisées par la désorganisation/(ré)organisation du myocarde seront étudiées : le développement ontogénique et le remodelage ischémique du myocarde. L’expression de CASK sera manipulée in vivo (AAV) chez le rat nouveau-né et adulte pour étudier le rôle de CASK sur la fonction cardiaque et le myocarde ex vivo (biochimie, immunofluorescence et électrophysiologie). L’expression de CASK dans les zones bordante et distante de l’infarctus sera étudiée, puis l’expression de CASK sera manipulée in vivo (AAV) pour déterminer si CASK peut prévenir ou aggraver le remodelage.

Originalité et pertinence par rapport à l’état des connaissances: Les mécanismes qui régulent le trafic du canal NaV1.5 vers les domaines spécialisés des CM sont méconnus. Dans le contexte des cardiopathies où l’organisation tridimensionnelle du tissu est altérée, un adressage inapproprié des canaux constitue un facteur majeur de remodelage électrique. Ainsi, la compréhension de l’organisation spatio-temporelle du canal NaV1.5 et de ses partenaires en conditions physiologique et pathologique devrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant le trafic intracellulaire.