L'échafaudage d'actine/spectrine façonne la physiologie de l'axone – ASHA

Microscopie optique avancée

Le Partenaire 1 est un spécialiste reconnu de l'application de la microscopie à super-résolution à l'étude du cytosquelette neuronal. Nous avons déployé toute une gamme de techniques avancées : Microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM : microscopie de reconstruction optique stochastique STORM, accumulation de points d'ADN dans la topographie à l'échelle nanométrique DNA-PAINT) pour résoudre les détails structurels jusqu'à environ 20 nm dans des cellules fixées ; microscopie à illumination structurée (SIM) qui atteint une résolution d'environ 100 nm dans les cellules vivantes ; microscopie à réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser l'exocytose d'une seule vésicule le long de l'axone.

Microscopie électronique

Le Partenaire 2 est un spécialiste de renommée internationale de la microscopie électronique à réplique de platine (PREM), qui permet d'étudier l'architecture ultrastructurale du cytosquelette associé à la membrane dans des cellules cultivées. À ce jour, seule cette approche a permis de visualiser l'échafaudage axonal d'actine/spectrine par microscopie électronique, montrant que les anneaux d'actine étaient constitués de deux longs filaments entrelacés (Vassilopoulos et al., 2019 10.1038/s41467-019-13835-6).

Approches corrélatives

Nous avons développé plusieurs approches qui maximisent les connaissances en combinant différentes techniques de microscopie sur un même échantillon : la PREM/STORM et la PREM/SIM corrélatives d'échantillons immunomarqués ont permis d'identifier l'identité moléculaire des détails ultrastructuraux ; la microscopie TIRF/STORM corrélative sur cellules vivantes a permis de cartographier l'environnement nanométrique des sites d'exocytose.

• Régulation de l'endocytose axonale par la structure d'actine/spectrine

L'hypothèse centrale du projet était que l'échafaudage d'actine/spectrine fonctionne comme une couche isolante qui limite l'échange membranaire le long de l'axone. Cette hypothèse a été testée en analysant l'endocytose médiée par la clathrine au niveau du segment initial de l'axone en combinant la microscopie de super-résolution et la microscopie électronique à réplique de platine. Ceci a démontré que les puits clathrine ne sont pas répartis de manière aléatoire le long des axones proximaux, mais se forment dans des zones circulaires distinctes dépourvues de maillage d'actine/spectrine. Ces puits de clathrine sont exceptionnellement stables, ce qui se traduit par une activité endocytique très faible le long du segment initial de l'axone. La perturbation de la structure de spectrine augmente la formation de puits de clathrine, démontrant que la structure limite physiquement l'endocytose. Il est important de noter que l'endocytose au niveau du segment initial de l'axone peut être activement déclenchée par une stimulation physiologique. L'activité neuronale induit la polymérisation d'actine ramifiées autour des puits de clathrine, favorisant leur scission et leur internalisation. Ces résultats révèlent une régulation à deux niveaux de l'endocytose axonale : une restriction structurelle imposée par le squelette d'actine/spectrine et un mécanisme dépendant de l'activité qui débloque l'endocytose lorsque cela est nécessaire. Ces travaux bouleversent le dogme selon laquelle l'endocytose axonale est absente ou négligeable en identifiant un réservoir régulé de sites d'endocytose intégré dans le squelette axonal.

Ces résultats ont été prépubliés en décembre 2023 (10.1101/2023.12.19.572337) et publiés dans Science en août 2024 (Wernert, Moparthi et al. 10.1126/science.ado2032), puis récompensés par le prix « Grandes Avancées Française en Biologie » de l'Académie des Sciences en 2025.

• Existence d'une exocytose non synaptique le long de l'axone et régulation par l'échafaudage d'actine/spectrine

Dans la deuxième partie de ce projet, nous nous sommes concentrés sur l'exocytose le long de l'axone. Nous avons développé une technique TIRF rapide et sensible sur cellules vivantes pour visualiser l'exocytose sur des vésicules individuelles le long de l'axone, révélant l'existence d'une petite fraction d'événements exocytiques en dehors des présynapses dans les neurones au repos. Tout comme l'endocytose, cette exocytose le long du corps axonal est restreinte par l'échafaudage d'actine/spectrine. À l'échelle nanométrique, le TIRF/STORM multicolore corrélative sur cellules vivantes a montré que, comme l'endocytose, l'exocytose se produit dans les trous du réseau d'actine/spectrine, mais que ces trous sont distincts des clairsemés qui contiennent des puits de clathrine.

Ces résultats ont été prépubliés en septembre 2025 (Wiesner et al. 10.1101/2025.09.17.676728).

Ce projet a connu un fort succès, entraînant un changement profond dans notre compréhension des rôles cellulaires du squelette périodique d'actine/spectrine et de la physiologie des axones. Il a également ouvert de nouvelles perspectives sur le mécanisme de l'endocytose médiée par la clathrine : ses caractéristiques uniques dans les axones peuvent être utilisées de manière comparative pour comprendre son fonctionnement dans toutes les cellules. L'importance de nos résultats et la beauté des images obtenues grâce à nos techniques de microscopie ont permis de toucher un public au-delà de la communauté des spécialistes. Cela contribue à réaffirmer le rôle de la science et de la découverte dans un monde où le savoir et l'expertise sont remis en question.

Dans les neurones, l'axone porte le potentiel d'action et transmet le signal vers les cellules cibles. Sa morphologie unique est rendue possible par un cytosquelette spécialisé. Un échafaudage périodique d'actine/spectrine corticales a récemment été découvert le long des axones grâce à la microscopie de super-résolution, mais ses fonctions restent mystérieuses. Nous avons récemment combiné l’imagerie super-résolutive à la microscopie électronique sur réplique de métal pour révéler l'ultrastructure de cet échafaudage axonal. Notre objectif est maintenant de déterminer son rôle dans la morphologie et la physiologie de l'axone. Nous voulons montrer que cet échafaudage restreint l'endo/exocytose le long du fût axonal, permettant un transport ciblé sur de longues distances jusqu'aux synapses. Nous disséquerons les processus mal connus de l'endocytose et de l'exocytose axonales en utilisant notre combinaison unique d'imagerie sur cellules vivantes, ainsi que de microscopie de super-résolution et électronique corrélatives. Nous démantèlerons l'échafaudage sous-membranaire le long de l'axone proximal et/ou distal en déplétant les spectrine axonales à l'aide de vecteurs viraux validés. Nous évaluerons l'organisation moléculaires des assemblages de clathrine, de l'endocytose et de l'exocytose dans ces axones dépourvus de spectrine, depuis leur dynamique jusqu'à leurs détails ultrastructuraux. Ceci révélera comment l'échafaudage périodique d'actine/spectrine régule l'accès à la membrane plasmique de l'axone. Nous démontrerons comment cette régulation de l'endo/exocytose est déterminante pour l'établissement de l'arborisation axonale, ainsi que pour l'organisation fonctionnelle des présynapses. Enfin, nous testerons la pertinence physiologique de nos découvertes en étudiant comment des mutants pathologiques des spectrines axonales altèrent ces processus dans les neurones humains. Des mutations de spectrines précédemment identifiées chez des patients humains seront introduites dans le génome de cellules souches pluripotentes induites par la technique CRISPR/Cas9, et nous différencierons ces cellules souches en neurones matures. Nous étudierons dans ces neurones l'organisation de l'échafaudage périodique axonal et le dérèglement potentiel de l'endo/exocytose causés par ces mutations.