Etapes initiales de la synthèse de la grande sous unité ribosomique eucaryote – RIBOPRE60S

Le ribosome catalyse la synthèse de la liaison peptidique durant la traduction. Le ribosome est constitué d’une petite et d’une grande sous unité, chacune possédant un squelette d’ARN sur lequel sont fixées des protéines ribosomiques (PR). Le ribosome est un ribozyme car son centre catalytique, porté par la grande sous unité 60S, est constitué d’ARN ribosomique (ARNr). En conséquence, un des aspects clés de la synthèse des ribosomes est le repliement correct des ARNr requis pour une activité optimum des ribosomes. Chez les eucaryotes, cette synthèse implique l’assemblage et la maturation de particules pré-ribosomiques qui contiennent des pré-ARNr, des PR, des snoRNP et des facteurs d’assemblage (FA). Les évènements d’assemblage et de maturation conduisant à la formation de la première particule pré-60S, le premier précurseur de la sous unité 60S, sont d’une importance cruciale pour la synthèse de la grande sous unité. Pourtant, ils figurent parmi les étapes les moins étudiées de la synthèse des ribosomes. Dans la sous unité 60S mature, les ARNr 25S et 5.8S sont repliés en 6 domaines structuraux (I à VI), chacun débutant par une hélice racine. Les rares données concernant la première particule pré-60S indiquent que l’hélice racine I et les appariements entre les ARNr 25S et 5.8S, éléments clés du repliement du domaine I, sont déjà établis dans cette particule. Il est admis que des défauts dans ces étapes précoces de repliement du pré-ARNr conduisent à l’élimination de la première particule pré-60S. Plusieurs FA présents dans cette particule, notamment les membres du complexe Npa1, sont requis pour son accumulation normale et ont été désignés « formation » (f)AF. Ces fAF pourraient jouer des rôles cruciaux lors des évènements précoces de repliement du pré-ARNr. La première particule pré-60S contient aussi de nombreuses snoRNP catalysant la méthylation et la pseudouridylation de certains résidus de l’ARNr 25S et dont l’association avec les pré-ARNr et leur dissociation influent sur son repliement. Nous avons aussi obtenu des données suggérant que la snoRNP contenant le snoARN snR190 fonctionne en tant que chaperon spécifique de repliement du pré-ARNr.
Le but du projet est d’élucider les évènements moléculaires conduisant à la formation de la première particule pré-60S chez la levure. Nous déterminerons les fonctions des fAF et de snR190 dans le repliement du pré-ARNr de la première particule pré-60S, dans l’assemblage des PR et dans le contrôle des interactions snoARN/pré-ARNr. Pour ce faire, nous identifierons les sites de fixation des fAF sur le pré-ARNr et déterminerons quels sont leurs partenaires directs (protéines ou snoARN) au sein de cette particule. Nous définirons également l’organisation structurale de la première particule pré-60S, notamment en termes de repliement de l’ARN. En nous référant à ces données, nous établirons ensuite dans quelle mesure l’absence ou la mutation de ces fAF ou de snR190 impacte le repliement du pré-ARNr et la composition protéique de la particule, ainsi que les interactions snoARN/pré-ARNr et les modifications du pré-ARNr. Le projet comportera également une étude biochimique exhaustive de certains fAF clés possédant des activités enzymatiques et visera à identifier comment leurs partenaires modulent leurs activités. Notre programme de travail comprendra des approches de pointe pour analyser les interactions protéines/ARN (CRAC, CLASH) in vivo, le repliement du pré-ARNr (SHAPE), la structure du complexe Npa1 et de la première particule pré-60S (CXMS, cryo-EM), la composition des particules pré-ribosomiques (spectrométrie de masse quantitative), ainsi que des approches biochimiques classiques pour analyser les activités enzymatiques de certains fAF. Ce projet apportera des données structurales et fonctionnelles cruciales concernant les premières étapes de la synthèse de la sous unité 60S eucaryote et élucidera les rôles moléculaires des fAF lors de ces étapes.