Les HYPERthermophiles et leur mécanisme de BIOMINeralisation – HYPERBIOMIN

Une combinaison d’approches expérimentales multidisciplinaires a été mise en œuvre afin d’étudier la biologie, la minéralogie, la biogéochimie des Thermococcales en condition de biominéralisation. La combinaison de la microbiologie, la géochimie, la minéralogie, la biologie moléculaire a assuré la nouveauté et l’originalité du projet.

La culture des microorganismes hyperthermophiles et les expériences de minéralisation ont été réalisées sous différentes conditions physico-chimiques : de températures (25°C, 45°C), de sources de fer (FeSO4, FeCl2, en concentrations variables) en présence ou en absence de cellules. Afin de suivre finement les étapes de biominéralisation, des prélèvements ont été effectués à différents temps d’intérêt sur une période maximale de 30 jours.

En parallèle, des expériences de production de pyrite abiotique ont été réalisées dans les mêmes conditions physico-chimiques (anaérobiose, 85 °C, présence de soufre réactif), en absence de cellules intactes. Ces expériences ont été menées en absence et en présence de différentes matières organiques (carbone graphitique, extrait de levure, lysats cellulaires), afin de disposer de références abiotiques comparables aux systèmes biologiques.

L’état physiologique et l’activité métabolique des cellules non minéralisées ont été analysés par : des comptages cellulaires en cytométrie en flux, des dosages d’ATP par ATPmétrie, des observations en microscopie confocale, des observations en cryomicroscopie électronique. La progression des cellules entièrement minéralisées, sous forme de sphérules de pyrite, a été évaluée par des comptages en microscopie électronique à transmission. La nature minéralisée des cellules (riches en fer et en soufre) a été confirmée par spectroscopie EDXS.

La quantification du fer dissous et du fer précipité a été réalisée par dosages colorimétriques à la ferrozine et par spectrométrie en MP-AES.

En parallèle, des analyses transcriptomiques ont été menées à différents temps d’intérêt du processus de biominéralisation. Un workflow a été spécialement développé pour les analyses transcriptomiques chez les Thermococcales et pourra être réutilisé pour des expériences futures par l’ensemble de l’équipe.

Les phases minérales produites et les interactions cellule/minéral ont été finement étudiées pour tous les échantillons, à l’aide d’un large éventail de techniques telles que : la diffraction des rayons X (DRX), la microscopie électronique à transmission, à balayage, la cryomicroscopie électronique (TEM, SEM, FIB-SEM, Cryo-EM), la spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDXS) et la microscopie électronique en transmission à balayage couplé à des analyses chimiques (STEM-EDX, STEM-EELS). Enfin, plusieurs échantillons ont été analysés par spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS) au synchrotron SOLEIL (au seuil K du fer sur la ligne SAMBA ; au seuil K du carbone sur la ligne HERMES) et au synchrotron SSRL de Stanford (seuil K du soufre sur la ligne 4-3).

Le projet HYPERBIOMIN a permis d’apporter des avancées majeures dans la compréhension des interactions microorganismes/minéral dans les environnements hydrothermaux profonds. Tous les résultats obtenus, ont mis en évidence le rôle central des archées hyperthermophiles de l’ordre des Thermococcales dans la formation des sulfures de fer, et ont permis de révéler des liens entre biominéralisation et adaptation des archées aux environnements extrêmes riches en fer et en soufre. Le projet HYPERBIOMIN a également permis d’identifier et de discuter des signatures minérales et organiques associées à ces processus, contribuant ainsi à une meilleure définition des critères de biosignatures dans les systèmes hydrothermaux.

Les Thermococcales, archées hyperthermophiles réductrices de soufre vivant dans les systèmes hydrothermaux, sont capables d’induire rapidement la formation de sulfures de fer : la pyrite (FeS₂) et la greigite (Fe₃S₄). À 85 °C, dans des milieux anaérobies riches en fer et en soufre, elles produisent en quelques heures des sphérules de pyrite associées aux cellules et aux vésicules. Les nanocristaux de pyrite se nucléent à la surface de la S-layer cellulaire, formant des sphérules lisses. Ces sphérules de pyrite biogéniques présentent des caractéristiques morphologiques et minéralogiques spécifiques et contiennent de la matière organique, ce qui leur confère un intérêt particulier dans la recherche de biosignatures.

La formation de pyrite est dépendante de la présence de soufre élémentaire (S⁰) dans le milieu. En excès de soufre, les Thermococcales accumulent des polysulfures et produisent des vésicules riches en soufre qui jouent un rôle clé dans la minéralisation. La pyrite se forme par une réaction de comproportionation (soufre élémentaire dans le milieu, soufre réduit (S²⁻) présent dans la mackinawite (FeS), phase minérale métastable initialement produite par interaction entre Fe²⁺ et H₂S). En l’absence de vésicules de soufre, aucune pyrite n’est formée, démontrant l’importance de la voie des polysulfures.

La cinétique de formation de la pyrite dépend de la nature et de la concentration du fer. Le mécanisme de production se maintient sur une large gamme de conditions, y compris à plus basse température (25–45 °C). Toutefois, des surfaces cellulaires intactes sont indispensables : ni des cellules fixées ni des contenus intracellulaires ne permettent la formation de pyrite.

La biominéralisation constitue une stratégie de détoxification du fer. La précipitation rapide de FeS protège initialement les cellules, mais provoque un stress physique létal. La transformation d’une fraction de la population en pyrite permet la survie d’une autre fraction, conduisant à une population hétérogène. Les cellules non minéralisées sur-expriment alors des gènes impliqués dans la réparation de l’ADN, la réponse au stress oxydatif et les mécanismes de détoxification, favorisant ainsi leur adaptation aux environnements extrêmes riches en fer et en soufre.

Les verrous scientifiques et techniques mis en évidence par le projet HYPERBIOMIN ouvrent de nouvelles perspectives de recherche pour une meilleure compréhension des processus de biominéralisation de sulfures de fer dans les systèmes hydrothermaux.

En particulier, les approches multi-omiques (protéomique, métabolomique) permettront de préciser les mécanismes moléculaires et métaboliques impliqués chez les Thermococcales.

Et l’intégration de l’étude des vésicules extracellulaires, dont le rôle dans la biominéralisation a été démontré mais reste insuffisamment caractérisé, ainsi que l’exploration du rôle jusqu’ici totalement méconnu des virus, constituent une étape clé pour dépasser nos modèles actuels.

C. Truong, S. Bernard, A. Gorlas, P. Le Pape, G. Morin, C. Baya, P. Merrot, P. Lefebvre and F. Guyot. Production of pyrite spherules by hyperthermophilic Thermococcales. (Submitted, Frontiers in Microbiology)

Gorlas A, Morey L, Mariotte T, Truong C, Bernard S, Guigner JM, Oberto J, Baudin F, Landrot G, Baya C, Le Pape P, Morin G, Forterre F and Guyot F (2022) Precipitation of greigite and pyrite by Thermococcales: adaptation to Fe- and S-rich environments? Environmental Microbiology 24: 626–642. doi: 10.1111/1462-2920.15915

Liu J, Soler N, Gorlas A, Krupovic V, Krupovic M, Forterre P (2021) Extracellular membrane vesicles and nanotubes in Archaea. Microlife 2: uqab007. doi: 10.1093/femsml/uqab007

Les sources hydrothermales océaniques profondes sont souvent des systèmes anaérobies riches en fer et en soufre. Alors que la pyrite FeS2 se forme abiotiquement à l’intérieur des cheminées à des températures élevées (> 250°C), un important stock de FeS2 (pyrite et marcasite) est également produit dans les parties plus froides des cheminées à des températures plus basses (< 150°C) par un mécanisme encore inconnu. Il a été montré en laboratoire que les Thermococcales, organismes prédominants des parties chaudes des sources hydrothermales, produisent rapidement d’abondantes quantités de pyrite (FeS2) dans les cellules et les vésicules, alors que de la greigite (Fe3S4) se forme sur les substances polymères extracellulaires (EPS), ce qui suggère qu’elles pourraient contribuer à la formation importante géochimiquement de FeS2 à « basse température ». Afin de fournir une évaluation de la contribution des Thermococcales et plus généralement de la biosphère hyperthermophile (T>80°C) aux cycles biogéochimiques, il est maintenant temps de progresser dans la compréhension du mécanisme de biominéralisation à haute température précédemment identifié. Thermococcus kodakarensis sera l’organisme de choix pour le projet HYPERBIOMIN, puisque de nombreux résultats intéressants ont déjà été obtenus pour cette souche et dans notre laboratoire ; les outils génétiques pour cette archée hyperthermophile sont bien établis. Le projet HYPERBIOMIN répond à trois questions principales :
(1) Quelles sont les conditions physiologiques des cellules et les paramètres physico-chimiques du milieu de vie qui influencent et contrôlent les minéraux produits par T. kodakarensis?
(2) Quelles sont les entités biologiques et les gènes impliqués dans les mécanismes de minéralisation par T. kodakarensis ?
(3) Quelles sont les stratégies adaptatives développées par les hyperthermophiles pour influencer et faire face à leurs environnements à haute température hautement minéralisés?
Pour répondre à ces questions, le projet suivra trois approches complémentaires :
(1) La première approche consiste à déterminer et à analyser quantitativement les minéraux produits dans différentes conditions physico-chimiques imitant l’environnement fluctuant des cheminées hydrothermales. Jusqu’à présent, j’ai limité les études de biominéralisation aux paramètres de croissance optimaux des Thermococcales. En collaboration avec un étudiant en thèse et un master, nous allons déterminer les impacts de la température et du pH, mais aussi des changements métaboliques des Thermococcales (production H2S vs production H2) induits par les conditions environnementales sur la composition, la structure et les propriétés des minéraux formés.
(2) La deuxième approche porte sur l’exploration des mécanismes moléculaires de biominéralisation par T. kodakarensis. À ce jour, aucune information n’est disponible sur les relations entre la production de minéraux et des gènes putatifs impliqués. Nous allons détecter et identifier les principaux partenaires moléculaires impliqués dans le mécanisme de biominéralisation de T. kodakarensis. Nous nous concentrerons d’abord sur les gènes codant pour les ferritines et les transporteurs de fer en raison de leur importance potentielle dans le processus de biominéralisation du fer. J’explorerai ensuite les gènes impliqués dans la synthèse et l’expression des vésicules qui ont été reportés comme impliquées dans la formation de pyrite par Thermococcales.
(3) Dans une troisième approche, j’étudierai l’importance de ces processus de biominéralisation pour les mécanismes d’adaptation des Thermococcales et des archées méthanogènes de l’écosystème hydrothermal. Des expériences impliquant à la fois T. kodakarensis et Methanocaldococcus jannaschii seront menées pour déchiffrer dans cet écosystème simplifié les réponses adaptatives face à l’environnement hydrothermal extrême, en présence ou absence de minéraux dont le rôle potentiel dans l’adaptation sera étudié.