Exploiter l'activité ARN hélicase à des fins de (ribo)régulation synthétique – HELISWITCH

Le projet HELISWITCH implique le développement, l’automatisation et l’exploitation d’un procédé de criblage innovant –Helicase-SELEX- qui permet d’identifier des séquences d’acides nucléiques capables de contrôler spécifiquement et, si possible, de manière conditionnelle, l’activité enzymatique d’une hélicase. Le mécanisme de contrôle de ces séquences, leur efficacité et leur spécificité ainsi que leur utilité pour des applications SynBio, sont ensuite évalués par une combinaison d’approches in vitro et in vivo

La pandémie Covid-19 a fortement perturbé notre programme de recherche initial. Elle a entravé le travail des personnels recrutés en CDD (confinements, reprise d’activité sous conditions), retardé la mise en service de la plateforme de criblage robotisée (La priorité évidente du constructeur étant la mise en service et l’exploitation des robots de dépistage Covid) et conduit à une très forte inflation des coûts de réactifs et consommables nécessaires au programme HELISWITCH. Les objectifs ont dû être réduits et la durée allongée pour maintenir le projet à budget constant. Néanmoins, des succès notables ont pu être obtenus. Le procédé Helicase-SELEX a été développé, optimisé, et automatisé avec succès. Il fait l’objet d’une demande de brevet international (WO 2022/073965). Plusieurs mécanismes de contrôle de l’activité de l’hélicase Rho ont été identifiés : par un ligand chimique (sérotonine) et par des stimuli physico-chimiques (T° ou pH). L’efficacité de ces contrôles a été vérifiée à l’aide d’essais enzymatiques in vitro et d’expériences in vivo, ouvrant potentiellement la voie à de nouveaux dispositifs SynBio exploitant ces stimuli/inducteurs. Une version « génomique » du procédé Helicase-SELEX a également été développée et exploitée pour identifier systématiquement les sites d’action de l’hélicase Rho au sein de génomes entiers de bactéries, offrant ainsi également des perspectives intéressantes en biologie fondamentale pour la compréhension des mécanismes d’adaptation bactérienne aux conditions environnementales. Ces résultats ont fait l’objet de plusieurs publications dans des revues scientifiques renommées et à comités de lecture.

Le nouveau procédé Helicase-SELEX pourra être exploité pour identifier des mécanismes hélicase-dépendants gouvernés par d’autres inducteurs ou stimuli d’intérêt. Cette recherche pourra être conduite avec Rho ou d’autres hélicases potentiellement intéressantes, par exemple d’origine eucaryote plutôt que bactérienne. Le criblage pourra être mené à partir de banques de séquences d’origine synthétique, génomique voir métagénomique pour encore mieux explorer la richesse potentielle d’échantillons provenant d’environnements soumis à des contraintes variées. Ces démarches devraient offrir des outils précieux pour programmer la réponse cellulaire ou créer les technologies de biodétection utiles pour le diagnostic médical et d’autres applications de terrain.

La biologie synthétique (SynBio) a pour but l’ingénierie rationnelle de nouvelles fonctions ou systèmes biologiques et leurs applications dans l’industrie, l’agriculture, l’environnement, la défense ou la médecine. C’est un segment de la bioéconomie en pleine expansion avec une part de marché mondiale déjà évaluée à plusieurs milliards d'euros.

Diverse applications en SynBio nécessitent des dispositifs biologiques pouvant être facilement reprogrammés pour détecter de nouvelles molécules d’intérêt (biomarqueurs, polluants, etc.) et convertir leur détection en signal observable (expression d’un rapporteur fluorescent, motilité cellulaire, etc.). Cependant, malgré les progrès récents, les dispositifs de détection capables d’être facilement adaptés à de nouveaux ligands font cruellement défaut, ce qui entrave le développement de nombreuses applications prometteuses.

Le projet HELISWITCH vise à apporter des solutions innovantes à ce problème majeur en SynBio. Nous offrirons une nouvelle classe de dispositifs programmables, inductibles par des ligands, qui exploitent les fonctions biochimiques et biologiques des hélicases. Ces enzymes sont impliqués dans tous les processus cellulaires liés aux acides nucléiques, y compris les étapes de l'expression génique. Par exemple, l'hélicase bactérienne Rho met fin à la transcription de gènes au niveau de sites spécifiques, tandis que l'hélicase eucaryote Upf1 induit la dégradation des ARNm en fonction de leur traduction. Rho et Upf1 possèdent une activité de moteur moléculaire ATP-dépendant qui peut également être exploitée avantageusement pour générer des signaux Synbio pertinents in vitro. Enfin, des hélicases comme Upf1 utilisent aussi bien l’ADN que l’ARN comme substrats, ce qui offre une grande flexibilité et une large gamme d’utilisations SynBio potentielles.

En utilisant Rho et Upf1 comme enzymes modèles, nous montrerons que les propriétés des hélicases constituent un avantage décisif pour améliorer la programmation de la réponse à de nouveaux ligands. Notre travail repose sur une nouvelle technologie innovante permettant la création de commutateurs moléculaires ligand- et hélicase-dépendants (heliswitches) que nous avons déjà validée pour générer un système rapporteur inductible par la sérotonine. Nous affinerons et adapterons cette technologie pour générer rapidement et automatiquement de nouveaux heliswitches. Notamment, nous développerons des procédures automatisées pour créer des heliswitches ‘ON’ ou ‘OFF’, dépendants de Rho ou Upf1, ou constitués d’ARN ou d’ADN. Ainsi, à partir de trois ligands modèles (sérotonine, kynurénine, cortisol) d’intérêt pharmacologique, nous créerons une collection de systèmes rapporteurs fonctionnant in vitro ou in vivo, chez les procaryotes ou eucaryotes, composés d’ARN ou d’ADN et reposant sur différents mécanismes, illustrant ainsi la grande évolutivité de notre technologie et sa fiabilité.

Enfin, nous démontrerons les avantages des heliswitches au travers plusieurs preuves de concept représentant des applications SynBio potentielles in vitro, in vivo ou avec des échantillons cliniques. Nous combinerons nos héliswitches sérotonine-dépendants à un rapporteur fluorescent pour cribler des banques de mutants de la tryptophane décarboxylase à la recherche d'enzymes capables de convertir rapidement un substrat (5-Hydroxytryptophane) en sérotonine. Nous développerons également des biocapteurs basés sur une activité hélicase in vitro (dissociation de duplexes ADN ou régulation génique dans des extraits cellulaires) et utiliserons ces derniers pour mesurer le niveau de cortisol (un marqueur pertinent de la dépression et du risque suicidaire) dans des échantillons cliniques de patients psychiatriques.

HELISWITCH offrira des outils précieux pour programmer la réponse cellulaire ou créer les technologies de biodétection utiles pour le diagnostic médical et d’autres applications de terrain.