Nouvelles approches analytiques adaptées à l’étude des biothérapies dans les milieux biologiques – MethAmAbs

Dans ce travail, nous avons développé une nouvelle stratégie analytique basée sur l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CE-MS/MS) pour la quantification de l'infliximab (Remicade®) dans le sérum humain. Le système CESI800 couplé à un spectromètre de masse 5600+ de type Q-TOF a été utilisé lors de cette étude. Une étape de purification a été optimisé afin d'obtenir des conditions d'échantillon parfaitement compatible avec l'étude en MS. Un échange de tampon sur membrane de cutoff 10 Da est réalisée pour éliminer l'excès de sels. Ensuite, les peptides d'infliximab obtenus à partir de la digestion trypsique ont été séparés et analysés par CE-MS/MS dans une stratégie de type bottom-up protémique. Afin de garantir une spécificité optimale, la quantification absolue a été élaborée à l'aide de peptides strictement spécifiques à l'infliximab et d'un standard interne. Le traitement des données bruts permettant d'obtenir les droites d'étalonnage ont été obtenues à l'aide des logiciels de traitement Skyline et Peakview.

La méthode CE-MS/MS a permis d'effectuer avec succès la quantification de l'infliximab dans du sérum dopé sur une gamme de concentration de 1 à 25 mg/L, ce qui représente les niveaux couramment observés chez les patients traités. La caractéristique de l'analyse CE-MS/MS a permis d'utiliser jusqu'à 7 peptides protéolytiques différents d'Infliximab pour la quantification. L'évaluation structurelle de cet anticorps monoclonal a également été réalisée en utilisant le même set de données que celui utilisé pour la quantification. Certaines modifications post-traductionnelles (PTM) d'intérêt, telles que les oxydations et les désamidations, ont été identifiées. La caractérisation de PTM peut être identifiée à partir du décalage de masse entre le peptide intact et son homologue modifié. Dans le cas de l'analyse MS/MS, la fragmentation CID du squelette peptidique a permis d'attribuer de manière précise le résidu concerné par le PTM. Les N-glycosylations de l'infliximab ont pu également être caractérisées de manière détaillée. Les résultats obtenus ont permis de déterminer avec succès les structures des glycanes majeurs de la protéine et d'établir un glyco-profilage détaillé, en accord avec le matériel de référence. Différents protocoles de préparation d'échantillons ont été étudiés pour améliorer l'intensité du signal. Pour s'assurer de la bonne compatibilité avec le couplage CE-MS, la viscosité et la concentration en sel ont été optimisées. Ainsi, l'étape d'échange de tampon a été étudiée et améliorée pour être adaptée à l'analyse.

A l’horizon des 6 prochains mois, le projet prévoit la finalisation de l’optimisation des conditions analytiques utilisées pour l’analyse d’échantillons de sérums par CE-MS/MS ainsi que la réalisation d’une validation de méthode complète afin de démontrer les performances, la justesse, la répétabilité et la fidélité intermédiaire de la stratégie analytique développée. Les travaux seront ensuite valorisés du point de vue fondamental concernant l’analyse de mAbs dans des échantillons biologiques par CE-MS/MS, ainsi que sur les aspects préparation d’échantillon compatibles avec l’analyse d’échantillons biologiques par CE-MS/MS. Au-delà de 6 mois, une fois la méthode CE-MS/MS validée, le projet se poursuivra par la réalisation des analyses CE-MS/MS d’échantillons de patients traités en gastro-entérologie seront réalisés.

Chapitre de livre

1. CE-MS methods for the characterization of monoclonal antibodies
T. Reinert, E. Leize-Wagner, P. Houzé, R. Gahoual, YN. Francois
Ramautar, Chen (Eds.): Capillary Electrophoresis- Mass Spectrometry (CE-MS) for Proteomics and Metabolomics Wiley-VCH (soumis)

Communication France
1. Absolute quantification and concomitant structural characterization of infliximab in biological samples using sheathless capillary electrophoresis - mass spectrometry
T. Reinert
SEP21, Paris, 5-7 octobre 2021

Conférence de vulgarisation
1. Quantification absolue et caractérisation structurale de l’Infliximab dans des échantillons biologiques par CE-MS
T. Reinert
Réunion UMR 7140, 5 mai 2021
2. Caractérisation et compréhension des aspects pharmacocinétiques et dynamiques de l’infliximab dans des sérums de patients atteints de la maladie de Crohn par CE-MS
T. Reinert
Séminaire UTCBS (UMR8258, 19 Janvier 2021)

Parmi les protéines thérapeutiques, les anticorps monoclonaux (mAbs) rencontrent un intérêt manifeste qui a contribué à l’avènement de l’industrie biopharmaceutique avec plus de 80 produits approuvés actuellement. Leur champ d’applications thérapeutiques est à l’heure actuelle stimulé par la cancérologie et le traitement de différentes maladies auto-immunes. Du fait de leur récente introduction en tant qu’agent thérapeutique, l’évolution des mAbs après administration souffre encore de connaissances approfondies, avec par exemple l’expression d’anticorps ciblant le mAbs et pouvant affecté potentiellement l’efficacité du traitement. De plus, alors que la dose prescrite est normalisée, les études antérieures montrent une élimination du mAbs dépendante du patient ce qui suggère un dosage non nécessairement optimale pouvant garantir une exposition constante du patient au traitement. La quantification de mAbs est communément réalisée par analyse ELISA qui cependant ne sont disponibles que pour une poignée de mAbs. L’autorisation régulière de nouveaux mAbs requiert le développement complet de nouvelles analyses ELISA dédiées employant des réactifs spécifiques. De plus, ce type d’analyses peut être sujet à des phénomènes d’interférences notamment dus à la matrice. Afin de lever les limitations induites par ce type d’analyse, ce projet de recherche a pour but la mise en œuvre d’une stratégie analytiques innovantes pour la quantification et l’analyse structurale simultanée de mAbs dans des échantillons biologiques complexes. Cette méthodologie possède la particularité d’être basée sur le couplage électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse en tandem haute sensibilité (CE-MS/MS). Cette approche s’appuie sur une instrumentation innovante afin de fournir une spécificité et une sensibilité optimale. De plus, l’analyse CE-MS/MS permet l’étude de l’intégrité de la protéine au cours du temps consécutif à l’administration au patient afin d’identifier l’apparition de modifications post-traductionnelles qui pourrait impacter les propriétés pharmacologiques du mAbs ou encore provoquer le déclenchement de réaction immunitaires. En particulier, les propriétés de la séparation électrophorétique permettront l’étude de l’évolution des différents glycoformes de manière indépendantes afin d’approfondir la mécanistique complexe gérant les traitements basés sur des mAbs thérapeutiques. La stratégie développée pour ce projet de recherche se focalise principalement sur l’analyse de mAbs ciblant le facteur de nécrose tumorale (TNF-a) dans les sérums de issus de patients. Après la validation statistique de la méthodologie, l’approche CE-MS/MS sera appliquée à l’étude d’échantillons de sérums issus de patients traités dans le cadre de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin tel que la maladie de Crohn. Les informations quantitative et structurale obtenues par l’intermédiaire de l’analyse CE-MS/MS seront ainsi corrélées avec les profils physiopathologiques des patients pour suivre l’adéquation de la dose engagée sur une période de temps étendue. En parallèle, les informations structurales seront exploitées afin d’étudier la formation de PTMs en corrélation avec des réactions spécifiques du patient au traitement. Les informations fournies par l’analyse CE-MS/MS permettront ainsi de révéler des aspects fondamentaux concernant l’évolution des mAbs après administration au patient. Le suivi spécifique fourni pourra ainsi aider les praticiens à ajuster le dosage en fonction du profil du patient. Ceci dans le but ultime de rationaliser les coûts induit par ce type de traitements à hautes valeurs ajoutées qui représentent à l’heure actuelle une charge significative pour le système d’assurance-maladie français. Enfin, la transposition de la méthode CE-MS/MS à l’analyse d’autres mAbs sera mise en œuvre afin de démontrer la transférabilité de cette stratégie analytique innovante à d’autres types de mAbs, induisant un développement additionnel réduit.