Sondes fluorescentes photocommutables et bicolores pour la bioimagerie avancée – BrightSwitch

Afin de prouver la spécificité de notre groupement de commutation, nous avons d'abord conjugué divers groupements à une coumarine par réaction de Wittig pour obtenir des styryl-coumarines. Cette approche a confirmé que nous avons identifié un groupement particulier capable de fournir DCPSF et a aidé à établir un mécanisme de photoconversion. Une fois synthétisés, les fluorophores sont analysés par spectroscopie pour déterminer leurs spectres d'absorption et d'émission dans diverses conditions ainsi que leur coefficients d'extinction et leur rendement quantique. Dans un second temps, les sondes sont photoconverties sous irradiation laser et les spectres de fluorescence sont instantanément enregistrés pour évaluer les propriétés de la forme commutée ainsi que pour établir la vitesse de conversion. Ensuite, la forme commutée est analysée par spectroscopie conventionnelle, spectroscopie de fluorescence résolue dans le temps et en HPLC couplée à la spectroscopie de masse.
Une fois le mécanisme établi, les propriétés de commutation ont été ajustées par des modifications chimiques sur le groupement de commutation. Il est en effet envisagé que des effets électroniques et stériques puissent moduler la vitesse de conversion. Des études sont en cours. Ensuite, le groupement de commutation a été couplé à divers fluorophores pour exemplifier notre technologie et pour fournir une large palette de sondes de différentes couleurs. Une fois de plus, la modification chimique aidera à affiner les propriétés des formes non commutées et commutées. Une fois les DCPSF avec les meilleures propriétés obtenues, ils seront fonctionnalisés par chimie click pour marquer des protéines taguées (SNAP, Clip, Halo, etc.) et pour cibler des organites spécifiques (mitochondries, fibres d'actine, Golgi etc.). Les sondes finales seront évaluées en microscopie à fluorescence conventionnelle avant d'être impliquées dans des techniques avancées de microscopie (Tracking, FRAP, super résolution).

Tout d'abord, en conjuguant des styryl-coumarines avec diverses groupements structurellement proches, nous avons démontré la spécificité de notre groupement de commutation (GC) à fournir des DCPSF. Ensuite, des études spectroscopiques avec irradiations laser et analyse HPLC / Masse ont permis d'établir sans ambiguïté le mécanisme de photoconversion. Le GC subit une photooxydation suivie d'une solvolyse conduisant à une coupure de la conjugaison entre le groupement de commutation et le fluorophore provoquant ainsi un décalage hypsochrome significatif de l'émission. Nous avons également établi que ce mécanisme ne fonctionne que si le fluorophore couplé était suffisamment riche en électrons. Indépendamment de notre GC, nous avons découvert un processus de photoisomérisation fluorogène conduisant à des sondes photocagées. Ensuite, par des modifications chimiques sur le groupement de commutation pour induire différents effets électroniques et stériques, nous essayons de moduler et de contrôler la cinétique de conversion.
Pour obtenir des sondes plus brillantes, nous avons ensuite appliqué notre technologie aux styryl-BODIPYs. Ces derniers sont des DCPSF efficaces avec un décalage d'émission de 100 nm entre la forme originale et la forme commutée. De plus, ces nouveaux DCPSF ont des spectres d'absorption et d'émission parfaitement adaptés à la microscopie. En parallèle, nous avons découvert que lorsque le GC était placé à une certaine position du noyau BODIPY, la fluorescence de ce dernier est éteinte. Cependant, sous irradiation, la fluorescence brillante du BODIPY est réactivée, constituant ainsi un nouveau mécanisme de photocaging fluorogène. Les premières études cellulaires ont montré que les DCPSF à base de BODIPY étaient pénetrent dans les cellules et photoconvertissent à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser. Nos résultats préliminaires ont montré que la conversion était trop efficace et devait être ralentie pour une utilisation optimale en bioimagerie.

Ce projet nous a d’ores et déjà permis de mettre à jour un nouveau mécanisme de photoconversion basé sur la photo oxydation du groupement de commutation (GC) et applicable à deux familles de fluorophore (BODIPY et coumarines). Le contrôle de cette réaction mène à des sonde fluorescentes photoconvertibles à deux couleurs qui ne manqueront pas de trouver leurs applications en bioimagerie. Il est d’ailleurs prévu de breveter cette technologie. L’enjeu est maintenant de contrôler cette conversion par ingénierie chimique et par étude spectroscopique. Les DCPSF possédant les caractéristiques les plus avantageuses pour la bioimageire serviront à marquer des protéines d’intérêt (par SNAP, Halo tag) ou cibleront des organelles spécifiques par couplage avec des groupements ciblants.
A terme, ce projet devrait pouvoir fournir des sondes fluorescentes bicolores photocommutables avec des vitesses de conversions, des propriétés photo physiques (couleur, photostabilité, brillance) et phototoxicités adaptées à l’étude de processus biologiques et au suivi de biomolécules par microscopie. Pour ce faire nous envisageons de continuer à étendre notre technologie à plusieurs fluorophores différents.

A ce jour, il n'y a pas encore de production scientifique. Une demande de brevet sera déposée prochainement. La stratégie de publication en découlera par la suite.

Les fluorophores photosensibles ou phototransformables capables de photoactivation, de photo-commutation ou de photoconverison sont de puissants outils en bio-imagerie permettant de suivre sans ambiguïté des biomolécules marquées sur de grandes échelles spatiotemporelles. En plus de cet avantage, ces molécules ont conduit à des avancées significatives en biophotonique en raison de leur capacité à être utilisées en imagerie super résolutive (PALM et STORM). Depuis la découverte de la paGFP en 2002, les protéines fluorescentes phototransformables sont prédominantes dans le domaine de la bioimagerie. Bien que cette approche soit robuste et puissante, elle n’est pas universelle car elle se limite aux protéines et nécessite donc une étape de transfection conduisant à une hétérogèneité et à des effets toxiques. Inversement, les sondes moléculaires se caractérisent par leur facilité d'utilisation, elles marquent les cellules de manière homogène et peuvent être utilisées en imagerie tissulaire. De plus, leurs modifications chimiques offrent davantage de possibilités d'amélioration par rapport aux protéines. Bien que les fluorophores photo-activables aient attiré une attention notable, ils ne révèlent leur fluorescence qu’après leur activation, limitant donc leur utilisation à la super-résolution. De même, les fluorophores photocommutables passent généralement d'un état non-émissif à une forme fluorescente et nécessitent une irradiation UV, qui est phototoxique.
De manière surprenante, les fluorophores commutables bicolores (DCPSFs) capables de passer d’une couleur à une autre, et qui peuvent donc être détectés de manière avantageuse avant leur conversion, ne sont que peu développés. Bien que des systèmes FRET complexes pouvant être séparés par photoirradiation aient été proposés, le développement de simple DCPSFs moléculaire reste extrêmement rare. En effet, dans la plupart des études, les propriétés de commutation de deux couleurs ont été évaluées sur des fluorophores disponibles dans le commerce tels que AlexaFluor 647 et des cyanines, ce qui ne permet pas une compréhension approfondie du développement de DCPSFs.
Ce projet vise à développer des fluorophores photocommutables bicolores (DCPSF) brillants et multicolores capables de passer d’une couleur à une autre en connectant des fragments photoactivables conjugués au système p des fluorophores. Ce projet est basé sur des résultats préliminaires prometteurs dans lesquels des DCPSFs spécifiques d’organites (mitochondries et membrane plasmique) ont été synthétisés et utilisés avec succès en imagerie par photoconversion et en super-résolution. Nous proposons ici de développer des DCPSFs portant une entité cliquable permettant leur post-fonctionnalisation afin de cibler non seulement des protéines (par marqueur SNAP ou Halo) mais également des organites spécifiques (mitochondries, noyau, réticulum, etc) en utilisant des molécules qui ciblent ces derniers afin de fournir des outils universels de détection en imagerie cellulaire. Ce projet vise également à comprendre, par des caractérisations photophysiques avancées le mécanisme conduisant à la photocommutation en établissant une relation structure/propriétés photophysiques. Une fois entièrement caractérisées (brillance, photostabilité, réversibilité, etc), les sondes seront évaluées dans des cellules par microscopie conventionnelle, puis utilisées en bio-imagerie avec des techniques de microscopie avancées, notamment en suivi de biomolecules, en FRAP et en super résolution. Le projet fournira une compréhension approfondie du développement des DCPSFs moléculaire et les sondes développées seront d'une grande utilité et d'un grand intérêt dans le domaine de la bio-imagerie.