Production de véritables lignées pluripotentes porcines: une étape clé pour le phénotypage moléculaire à grande échelle des caractères agronomiques – PluS4PiGs

Pour atteindre ses objectifs, le projet s’organise autour de cinq tâches scientifiques, partiellement interdépendantes. Elles font appel aux compétences et expertises des différents partenaires en génomique, protéomique, bioinformatique, reproduction animale et biologie des cellules souches.
Tâche 1 : Caractérisation moléculaire du micro-environnement embryonnaire
Nous produirons et utiliserons des données d’expression cellule-unique (scRNA-seq) et d’accessibilité de la chromatine (scATAC-seq) pour quatre stades de développement embryonnaire (blastocystes précoces, expansés, sphériques et ovoïdes). Le protéome des fluides utérins sera également caractérisé par spectrométrie de masse. L’ensemble de ces données sera utilisé pour identifier et caractériser les populations cellulaires présentes dans l’embryon ainsi que les interactions moléculaires entre les cellules d’une même population ou entre cellules de populations différentes.
Tâche 2 : Production de lignées cellulaires avec des systèmes rapporteurs de la pluripotence porcine
Grâce à la technologie CRISPR/Cas9, nous allons intégrer des gènes rapporteurs fluorescents en amont de promoteurs de gènes spécifiquement actifs dans les cellules pluripotentes (OCT4, NANOG, SOX2, UCHL1). La combinatoire des différents rapporteurs permettra de sélectionner et de visualiser avec précision les cellules ayant activées les réseaux de pluripotence endogène.
Tâche 3 : Définition d’une combinatoire de facteurs exogènes suffisants pour la reprogrammation vers un état de pluripotence
Nous allons utiliser les lignées intégrants les systèmes rapporteurs fluorescents pour la pluripotence endogène pour tester l’efficacité de nouveaux facteurs de reprogrammation identifiés à la tâche 1 (facteurs de transcription et effecteurs épigénétiques). Nous validerons les combinatoires de facteurs de reprogrammation en fonction de leur capacité à réactiver les rapporteurs fluorescents.
Tâche 4 : Criblage de petites molécules bioactives capables de maintenir la pluripotence porcine in vitro
Nous allons utiliser les lignées produites à la tâche 2 et intégrants les systèmes rapporteurs fluorescents pour la pluripotence endogène et testerons l’activité de molécules bioactives sur le maintien de la pluripotence in vitro. Nous validerons les combinatoires de ces molécules en fonction de leur capacité à réactiver les rapporteurs fluorescents.
Tâche 5 : Etablissement de lignées pluripotentes porcines
A partir des données des tâches 1 à 4, nous identifierons les molécules et facteurs nécessaires et suffisants au maintien de la pluripotence porcine dans des cultures in vitro. Nous établirons des lignées pluripotentes à partir d’explants embryonnaire et à partir de cellules somatiques reprogrammées. Ces lignées seront caractérisées par leur profil transcriptomique et épigénomique, leur capacité à se différencier in vitro et in vivo.

projet en cours de réalisation

PluS4PiGs est un projet collaboratif qui vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la pluripotence embryonnaire dans l’espèce porcine. Le projet vise également à transférer les connaissances acquises pour faciliter l’utilisation des cellules pluripotentes porcines dans les études G2P (du génotype au phénotype), qui visent à déterminer la contribution des variations génétiques pour le déterminisme de caractères complexes. Ce projet offre des perspectives prometteuses dans différents domaines associés à un certain nombre d’avancées majeures:
Un fort potentiel d'innovation pour le secteur de la sélection animale : les cellules pluripotentes peuvent être utilisées pour accélérer l'identification de variants génétiques causaux contrôlant les traits de production, de santé et de bien-être. Le génome de ces cellules peut être aisément modifié pour comparer les effets de différents allèles dans les mêmes haplotypes et dans de nombreux types cellulaires différents. Ces informations peuvent ensuite être utilisées dans les modèles de prédiction pour la sélection génomique ou pour introgresser des allèles d’intérêt dans une population donnée. Au final, l'acquisition de cellules pluripotentes porcines aura des applications agronomiques majeures notamment pour améliorer le pouvoir prédictif de la sélection génomique et la pérennité de la filière porcine française et européenne.
Un modèle stratégique pour le phénotypage ex vivo et pour réduire l'expérimentation animale : Les lignées cellulaires pluripotentes représentent un excellent système biologique pour étudier la différenciation cellulaire et l'organogenèse ex vivo grâce au développement récent de systèmes de culture cellulaire 3D. Ces protocoles sont maintenant largement utilisés pour produire des organoïdes à partir de cellules pluripotentes humaines et pour définir ex vivo de nouveaux traitements pour des pathologies dites complexes. L'extension de ces approches aux cellules pluripotentes porcines permettra le phénotypage à grande échelle de caractères difficiles et/ou coûteux à mesurer in vivo, et ce, sans augmenter le recours à l’expérimentation animale, un enjeu éthique et sociétal majeur. En effet, ce projet contribuera activement au développement de méthodes alternatives à l'expérimentation animale, qui est aujourd'hui une nécessité.
Une recherche fondamentale de pointe : les porcs représentent un modèle précieux pour découvrir de nouveaux mécanismes et marqueurs de pluripotence. Contrairement à l’homme et la souris, le développement embryonnaire du porc est caractérisé par une longue phase pré et péri-implantatoire in utero similaire à celle de la plupart des autres mammifères. Notre étude conduira à de nouvelles découvertes sur les mécanismes moléculaires contrôlant la pluripotence et mettra en évidence leur conservation et/ou divergences entre les espèces de mammifères.

projet en cours de réalisation

L'augmentation de la demande mondiale de produits carnés conjuguée aux changements globaux nous obligent à repenser nos systèmes de production. Il est nécessaire de réduire la pression des élevages sur les écosystèmes, d'améliorer la sécurité alimentaire et sanitaire et de prendre en compte le bien-être des animaux. Pour atteindre ces objectifs, une meilleure connaissance du lien entre génotype et phénotype est nécessaire. Le développement d'outils cellulaires efficaces est essentiel pour répondre à ce nouveau défi car ceux-ci sont plus adaptés pour générer de grandes quantités de données biologiques à travers des criblages et des analyses fonctionnelles automatisées. De plus, ils sont mieux acceptés socialement et éthiquement, plus sûrs en terme de biosécurité et ils réduisent le besoin d'expérimentation animale en accord avec la règle des 3R. Au sein des différentes stratégies qui peuvent être mises en œuvre, la production et l'utilisation de cellules souches pluripotentes (PSC) sont idéales car ces cellules peuvent se différencier in vitro et in vivo vers tous les lignages cellulaires et leur génome peut être facilement manipulé ou édité. Ces caractéristiques font des PSCs des outils cellulaires performants pour évaluer la causalité de variants génétiques associés à des traits complexes et des phénotypes cellulaires spécifiques.
Cependant, malgré les progrès réalisés chez la souris et le rat pour produire des PSCs, leur établissement chez le porc pose toujours problème notamment car leur état pluripotent repose sur l'expression continue de facteurs exogènes. Ceci a un impact sur leur potentiel de différenciation et limite fortement leur utilisation pour le phénotypage ex vivo et in vitro. Le fait que la production de vraies cellules pluripotentes chez le porc reste impossible par des procédures standard soulève de nombreuses questions sur les mécanismes moléculaires contrôlant la pluripotence chez cette espèce. Il est possible que les voies de signalisation moléculaires nécessaires au maintien de la pluripotence ne soient pas conservées ou que les cellules pluripotentes induites soient improprement reprogrammées et portent des barrières épigénétiques limitant leur pluripotence. Nous proposons d'évaluer les deux hypothèses chez le porc, en considérant le microenvironnement spécifique de l’embryon préimplantatoire porcin.
Nous caractériserons les profils épigénomiques de blastocystes porcins aux échelles unicellulaires et tissulaires et le protéome des fluides utérins aux stades embryonnaires correspondants. Nous intègrerons ces informations avec les données transcriptomiques déjà disponibles pour inférer des réseaux de régulation qui contrôlent la pluripotence dans le blastocyste porcin (Tâche 1).
En parallèle nous produirons des lignées cellulaires intégrant des rapporteurs fluorescents pour tracer la pluripotence endogène (Tâche 2) et nous utiliserons ces outils innovants (lignées reportrices et données omiques) pour réaliser un criblage de petites molécules et cytokines capables de soutenir la pluripotence in vitro et l'auto-renouvellement cellulaire (Tâche 4). Une fois défini, nous utiliserons ce système de culture optimisé pour améliorer le processus de reprogrammation (Tâche 3). Notre but est d’éliminer les barrières épigénétiques résiduelles par la définition de nouveaux cocktails de facteurs de reprogrammation et de modificateurs épigénétiques (identifiés via la Tâche 1). Nous proposons enfin de confirmer l'état pluripotent des lignées cellulaires produites au cours de ce projet par une caractérisation moléculaire complète et en évaluant leur capacité à coloniser des embryons receveurs (Tâche 5).
En résumé, notre projet intègre différentes approches (descriptives, fonctionnelles et expérimentales) pour permettre la production de véritables cellules souches pluripotentes porcines.