Conception de molécules pour lutter contre le virus de la bronchiolite grâce à une nouvelle cible thérapeutique – AntiBronchio

Une molécule inhibitrice d’une interaction entre deux protéines se fixe à l’endroit de contact entre les deux protéines, souvent en mimant un des deux partenaires protéiques, et empêche ainsi leur assemblage. Si le VRS mute à l’endroit de fixation de ces molécules, celles-ci perdent leur efficacité, mais le virus perdrait en même temps sa capacité à se multiplier.

Une stratégie possible consiste à utiliser des molécules directement dérivées de la structure chimique de la phosphoprotéine (approche peptidique). Une autre stratégie consiste à utiliser des molécules avec des fonctions chimiques proches. Une première famille de molécules disponibles commercialement avait démontré sa capacité à rentrer en compétition avec la phosphoprotéine pour s'associer avec la nucléoprotéine in vitro. L'objectif était d'optimiser ces molécules pour qu'elles rentrent plus facilement dans la cellule et pour qu'elles présentent une activité antivirale, sans être toxiques. Pour ce faire, de nouvelles molécules sont synthétisées, en faisant varier certaines fonctions chimiques clés de manière systématique. La conception de ces molécules est assistée par ordinateur pour prédire à grande échelle la probabilité de se fixer à la nucléoprotéine.

Ces nouvelles molécules sont d'abord testées in vitro pour tester l'inhibition de l'interaction entre les deux protéines. Cela requiert d'avoir un test robuste spécifique et à haut débit pour mesurer le pouvoir d'inhibition de ces molécules. Un tel test est mis au point dans le cadre de ce projet, à partir d’une solution contenant les deux protéines virales. Pour obtenir des informations supplémentaires sur le mode d'action, des données structurales à l'échelle atomique sont générées par cristallographie.

Les molécules les plus prometteuses sont ensuite testées toujours in vitro, mais dans des cellules infectées avec le VRS. Ces manipulations se font en laboratoire sécurisé. Des tests en cellules sont aussi utilisés pour mesurer leur toxicité potentielle. Seules des molécules non toxiques avec une activité antivirale suffisante in vitro peuvent plus tard être utilisées dans des tests dans un modèle de souris.

Afin de maximiser les chances de trouver des molécules actives, des librairies comportant des milliers de molécules commerciales sont également testées in vitro, avant de passer par une phase d'optimisation similaire à celle de la famille de molécules identifiées en début du projet.

Un test in vitro basé sur la fluorescence a été mis au point avec succès à partir de protéines isolées. Il a été calibré avec la molécule initiale (M76).

Pour la recherche de molécules inhibitrices par approche peptidique, 45 peptides mimant la partie de la phosphoprotéine du VRS qui s'accroche à la nucléoprotéine ont été synthétisées à partir d’acides aminés naturels et non naturels. Aucune molécule intéressante n'a été identifiée. L'activité mesurée dans le test de fluorescence était très faible, et aucune activité antivirale n’a été détectée dans les cellules infectées par le VRS.

L'optimisation de la molécule M76 a permis d'établir plusieurs règles chimiques pour lui permettre de rentrer dans la cellule et se fixer sur la nucléoprotéine. Une librairie de 7 000 molécules a été conçue par ordinateur. 50 molécules ont été sélectionnées pour être synthétisées chimiquement. Plusieurs variants plus actifs que M76 in vitro ont été identifiés grâce au test de fluorescence. Pour 5 molécules, des détails à l'échelle atomiques ont été obtenus par cristallographie. En revanche, la fenêtre thérapeutique de ces molécules était très étroite et ces molécules ne sont donc pas de bons candidats-médicaments.

Le criblage de la librairie de molécules French-PPIChem a permis d’identifier une série de molécules inhibitrices très différente de M76. De nouvelles molécules ont été synthétisées sur cette base. 200 variants commerciaux ont été testés en plus. Mais les activités antivirales sont très modestes.

En conclusion, ce projet a permis d'obtenir une connaissance plus approfondie sur la façon dont s'associent la phosphoprotéine et la nucléoprotéine du VRS. En effet, le mécanisme est très éloigné d'un modèle de clé-serrure où une protéine s'imbrique parfaitement dans sur l'autre. La phosphoprotéine est une protéine molle qui utilise un seul point d'ancrage bien défini, mais très restreint, et une multitude de points d'ancrages plus faibles à la façon d'un velcro. Le projet a aussi apporté des connaissances sur la stratégie à adopter pour concevoir de petites molécules inhibitrices de l’interaction entre ces protéines. Cependant ce projet n'a pas permis de faire émerger de molécule suffisamment pertinente pour engager des tests précliniques dans un modèle animal.

Si nous avons réussi à établir plusieurs règles chimiques pour améliorer les propriétés des molécules qui se fixent sur la nucléoprotéine du VRS à la place de la phosphoprotéine, les molécules que nous avons conçues ne sont pas assez efficaces en tant que molécules antivirales. Ces résultats indiquent que l'interaction entre ces deux protéines est difficile à bloquer et demanderait un investissement très important pour tester beaucoup plus de molécules. Or d'autres interactions entre protéines virales du VRS sont actuellement à l'étude, par le consortium, en particulier l'interaction entre la phosphoprotéine et la protéine virale M2-1. Cette interaction est également essentielle pour la multiplication du virus. Elle est centrale pour la production de protéines virales dans la cellule hôte. Nous cherchons des molécules qui se fixent sur M2-1 et qui entrent en compétition avec la phosphoprotéine du VRS (ANR "RSV-RApstop"). Dans ce cas, la surface de contact entre les deux protéines est plus grande et mieux définie que pour la surface entre nucléoprotéine et phosphoprotéine de VRS. L’approche peptidique semble prometteuse.

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable de bronchiolites, une cause majeure d’hospitalisations et de décès par infection virale chez les nouveau-nés dans le monde. Aucun vaccin n’a pu être mis au point. Seuls deux produits antiviraux sont disponibles, mais ne sont administrés que dans des cas extrêmes en raison de leurs faibles rapports bénéfice/risque ou bénéfice/coût. Dans ce contexte il est nécessaire de développer de nouveaux traitements, plus efficaces et moins onéreux. Le développement de thérapies antivirales pour le VRS repose aujourd’hui soit sur l’inhibition de l’entrée du virus dans la cellule, soit sur l’inhibition de la polymérase virale dans le cytoplasme de cellules infectées. Les deux stratégies ont abouti à quelques molécules/anticorps en test clinique de phase 2. Mais ces composés comportent tous des points faibles, entre autre des résistances croisées, ce qui appelle à trouver des solutions alternatives et complémentaires.
Nous proposons ici d'exploiter une voie pour l’instant peu explorée, visant à inhiber non pas l’activité catalytique de la polymérase virale, mais l’étape qui précède la synthèse d’ARN viral, à savoir la reconnaissance du matériel génomique viral par la polymérase. Cette reconnaissance est médiée par une interaction directe entre deux protéines virales : la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). Cette interaction est essentielle à la réplication du virus. Elle n'a pas d’équivalent cellulaire et constitue donc une cible pour la conception de nouveaux médicaments.
Nous avons précédemment caractérisé les déterminants structuraux de la fixation de P sur N, notamment par cristallographie. Par criblage virtuel nous avons trouvé des molécules mimant les 2 résidus C-terminaux de P, qui se lient dans une poche hydrophobe sur N et inhibent l'interaction P-N in vitro. Une de ces molécules (M76) a une affinité pour N comparable à celle de P. M76 a montré un effet antiviral in cellula, mais avec une approche pro-drogue. Récemment nous avons amorcé une étude de relation structure-activité (RSA) avec des variants de M76. Les résultats confirment le potentiel de ces variants pour inhiber la réplication du VRS. Mais il est nécessaire d'optimiser leurs propriétés en termes de perméabilité membranaire, d’activité antivirale et d’innocuité. Nous proposons des stratégies complémentaires pour explorer l'espace chimique de ligands de N : 1) pharmacomodulation de M76 sur la base de nos résultats récents, 2) approche peptidomimétique, 3) exploration de novo de N en tant que cible. Pour cela nous combinerons étroitement synthèse chimique et conception in silico. Des criblages expérimentaux de ces molécules/peptidomimétiques seront effectués par anisotropie de fluorescence (FA) afin de sélectionner des composés compétiteurs de P, avec une bonne affinité pour N. Un test antiviral en culture cellulaire avec un virus recombinant fluorescent développé dans le consortium sera utilisé de manière systématique pour évaluer leur activité après élimination des composés cytotoxiques. Des informations structurales à résolution atomique seront apportées par RMN et par cristallographie pour les meilleurs candidats. Elles serviront à amorcer de nouveaux cycles de RSA. Un minigénome VRS permettra de valider la cible en cellule. Les meilleurs composés seront alors testés sur des modèles de souris infectées avec un virus recombinant luminescent. L'innocuité des composés sera estimée par analyse histopathologique sur des souris traitées.
Notre consortium a une expérience unique dans l’étude du complexe polymérase du VRS. Il réunit toutes les compétences complémentaires en chemo-bio-informatique, chimie thérapeutique, biologie structurale et virologie et des outils de pointe nécessaires pour une étude préclinique complète et faire émerger une molécule phare, antivirale spécifique du VRS en s’appuyant sur une cible thérapeutique originale.