Cibler la D-alanylation des acides téchoïques pour combattre les pathogènes à Gram positif d'intérêt clinique – Dalatar

Détermination du traitement antibiotique le plus efficace sur des souches mutantes déficientes en D-alanylation des TAs : Il s’agira de construire des souches mutantes par délétion d’un ou plusieurs gènes de l’opéron dlt chez E. faecium, SARM, SERM et C. difficile. L’absence de D-alanylation est vérifiée par quantification des résidus D-Ala dans les TAs. La sensibilité de chaque mutant cultivé en présence d’antibiotiques en monothérapie ou en combinaison est comparée à celle de la souche sauvage par des analyses physiologiques (CMI, survie et biofilm). Ainsi, cela nous permet de définir le traitement antibiotique le plus efficace à utiliser en présence des inhibiteurs de la D-alanylation à tester.
Synthèse et tests de nouveaux inhibiteurs de la D-alanylation des TAs : L’inhibiteur de DltA qui nous a permis d’obtenir nos résultats préliminaires présente des limites de pénétration cellulaire et stabilité. Une première série de synthèses chimiques a pour but de résoudre ces difficultés, en apportant des modifications structurales de l’inhibiteur. D’autres séries sont mises en œuvre pour synthétiser de nouveaux inhibiteurs spécifiques de DltA et de DltC. L’efficacité de ces inhibiteurs est testée in vitro en déterminant leur valeur de concentration inhibitrice médiane (IC50). Pour cela les protéines DltA et DltC de chacun des pathogènes étudiés sont purifiées. Les inhibiteurs ayant la meilleure activité vis-à-vis de leur cible sont retenus pour analyser leur efficacité sur des cultures bactériennes.
Validation fonctionnelle des nouveaux inhibiteurs in vivo : De nouvelles analyses physiologiques sont menées chez les souches sauvages en présence d’inhibiteur combiné avec les antibiotiques sélectionnés précédemment. Ces mêmes expériences sont réalisées chez les mutants dlt afin de confirmer la spécificité des inhibiteurs vis-à-vis de leur cible.
Efficacité des inhibiteurs sur modèle animal. Les DL50 des souches (excepté C. difficile) sont déterminées en infectant des larves de Galleria mellonella. Des chenilles sont également infectées par les mutants dlt correspondants. L’innocuité des inhibiteurs est déterminée en administrant de larges gammes de concentrations des molécules d’intérêt. Afin de sélectionner la ou les combinaisons optimales permettant la protection des chenilles infectées, des gammes de concentrations d’antibiotiques associés ou non à des gammes d’inhibiteurs de la D-alanylation leur sont administrées. Les meilleures « thérapies » sont par la suite retenues pour être évaluées sur modèle murin. Pour chaque pathogène, ces combinaisons antibiotiques/inhibiteurs seront injectées à des souris infectées afin de mesurer leur efficacité sur la survie de l’animal. Enfin, ces expériences nous permettront d’évaluer la toxicité des inhibiteurs, mais également d’analyser l’impact des différents traitements sur le microbiote intestinal murin, notamment par des approches de séquençage global (métagénomique).

Des souches déficientes de la D-alanylation des TAs ont été obtenues à partir d’isolats cliniques des pathogènes E. faecalis, SARM et C. difficile. L’absence de D-alanylation pour les mutants a été confirmée par quantification des esters de D-alanine (D-Ala) contenus dans les TAs. De plus, la sensibilité des souches mutées et complémentées vis-à-vis de différents antibiotiques a été analysée in vivo (CMI, survie et biofilm), afin de sélectionner le traitement le plus efficace à utiliser en présence d’inhibiteur pour resensibiliser les pathogènes. Ainsi, les antibiotiques retenus sont une combinaison amoxicilline/céfotaxime pour les entérocoques, l’imipenème pour S. aureus résistant à la méticilline (SARM) et la bacitracine pour C. difficile. Concernant la synthèse des molécules inhibitrices de la D-alanylation, l’inhibiteur de référence (DLT-1) qui cible DltA de Bacillus subtilis a été le premier à être produit. Des modifications structurales (soit de la partie sucre ou du pont reliant l’alanine à l’adénosine) ont été apportées pour améliorer la pénétration cellulaire de DLT-1. La synthèse d’inhibiteurs de DltC est en cours par la modification de DLT-1 en introduisant un piège à thiol, dont le but est de se lier au CoA. De plus les protéines DltA et DltC d’E. faecalis et de C. difficile ont été purifiées. Les analyses d’IC50 des 24 molécules synthétisées à ce jour montrent que sept d’entre elles présentent une activité inhibitrice de DltA d’E. faecalis. Concernant la validation fonctionnelle des inhibiteurs in vivo, les résultats les plus notoires ont été obtenus avec l’inhibiteur DLT-1. Chez les entérocoques, celui-ci diminue la survie en présence d’une combinaison amoxicilline/céfotaxime. Chez les MRSA, l’inhibiteur sensibilise plusieurs souches cliniques à plusieurs ß-lactamines, principalement l’imipenème, en diminuant la CMI, la survie et la formation de biofilm. A noter que les phénotypes observés avec l’inhibiteur sont similaires à ceux obtenus avec les mutants dltA. De plus, nous avons montré chez ces pathogènes que l’inhibiteur provoque une forte diminution des résidus D-Ala contenus dans les TAs. L’ensemble des résultats suggérait une faible stabilité et/ou pénétration des 7 molécules ciblant DltA in vitro. Les premières analyses de stabilité en milieu de culture montrent que l’inhibiteur de référence est stable. Cependant, celui-ci présente une mauvaise pénétration dans la cellule bactérienne. Enfin, nous avons testé l’efficacité de DLT-1 sur la survie de Galleria mellonella. Ainsi, associé à une combinaison amoxicilline/céfotaxime, l’inhibiteur améliore significativement la survie des chenilles suite à une infection avec des souches cliniques d’entérocoques (E. faecalis et E. faecium). Le même effet de l’inhibiteur a été constaté en présence d’imipenème pour des larves infectées avec des souches de SARM.

Ce projet se focalise sur les pathogènes présentant un niveau de menace grave (entérocoques et staphylocoques) et d'urgence (C. difficile). Le développement des multirésistances aux antibiotiques a évolué plus rapidement que l'introduction de nouveaux médicaments, limitant considérablement les options thérapeutiques. Cela pourrait compromettre la capacité de lutter contre les maladies infectieuses, en particulier chez les patients vulnérables. Par conséquent, l'élaboration de nouvelles stratégies de traitement présenterait des avantages économiques et sociétaux importants. Dans cette optique, le projet Dalatar évalue le potentiel de nouveaux médicaments innovants inhibant la D-alanylation des TAs en tant qu'agents combinés pour sensibiliser ou « resensibiliser » les principaux agents pathogènes à Gram positif aux antibiotiques. Les perspectives concernent d’une part, la mutagenèse du système Dlt de S. epidermidis et d’autre part la détermination de la combinaison antibiotique/inhibiteur la plus efficace chez ce pathogène. En parallèle, la caractérisation des mutants ?dlt de C. difficile sera poursuivie et les différents inhibiteurs associés aux antibiotiques mis en évidence pendant la première période seront testés chez ce pathogène. Parallèlement la synthèse de nouveaux variants de l’inhibiteur de DltA et celle d’inhibiteurs de la protéine DltC seront entreprises. A terme, nos résultats pourraient être exploités par le dépôt de brevets protégeant les nouvelles molécules ainsi que les combinaisons inhibiteurs/traitements antibiotiques les plus efficaces.

- Coupri, D., Budin-Verneuil, A., Hartke, A., Benachour, A., Léger, L., Lequeux, T., Pfund, E., & Verneuil, N. (2019). Genetic and pharmacological inactivation of d-alanylation of teichoic acids sensitizes pathogenic enterococci to ß-lactams. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 74(11), 3162–3169. doi.org/10.1093/jac/dkz322
- Coupri, D., Verneuil, N., Hartke, A., Liebaut, A., Lequeux, T., Pfund, E., & Budin-Verneuil, A. (2021). Inhibition of d-alanylation of teichoic acids overcomes resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. The Journal of antimicrobial chemotherapy. doi.org/10.1093/jac/dkab287
- Fontenelle, C., Thierry, T., Laporte, R., Pfund, E., & Lequeux, T. (2020). Selective preparation of tetrasubstituted fluoroalkenes by fluorine-directed oxetane ring-opening reactions – Special issue D. O’Hagan., Beilstein J. Org. Chem. 16, 1936-1946. doi:10.3762/bjoc.16.160.

Ce projet aborde le grave problème de l'augmentation mondiale de la résistance aux antibiotiques. Il vise à développer des adjuvants renforçant l'action des antibiotiques conventionnels pour rétablir la sensibilité des agents pathogènes résistants à ces médicaments. Dans ce contexte, nos résultats préliminaires montrent que le système de D-alanylation est une cible prometteuse. Ce système comprend 4 gènes (dltABCD) codant pour les enzymes impliquées dans la modification des acides teichoïques (TAs) par ajout de D-alanine. Les TAs sont des polymères abondants de la paroi cellulaire de nombreuses bactéries à Gram positif. L’inhibition génétique ou pharmacologique de la D-alanylation des TAs a conduit à «re-sensibiliser» aux ß-lactames les entérocoques et Staphylococcus aureus résistants aux antibiotiques. L’inhibiteur utilisé dans ces expériences possède une haute affinité pour sa cible in vitro mais présente des limites in vivo. Le consortium de ce projet synthétisera et testera de nouveaux inhibiteurs de D-alanylation afin de sélectionner des molécules présentant des performances in vivo améliorées. Ces nouveaux adjuvants seront testés sur 5 agents pathogènes Gram positifs cliniquement critiques : Enterococcus faecalis, E. faecium, S. aureus, S. epidermidis et Clostridium difficile. Le projet est organisé en 4 tâches. Dans la tâche 1, nous construirons des souches déficientes en D-alanylation et testerons leur sensibilité aux ß-lactames (détermination de la CMI et survie) afin de définir les traitements antibiotiques les plus efficaces pour inhiber ou tuer ces mutants. L'absence de D-alanylation des TAs sera vérifiée par marquage de D-alanine 14C. Dans la tâche 2, trois séries de nouveaux inhibiteurs seront synthétisées chimiquement. La première série concernera la modification structurelle de l'inhibiteur de DltA utilisé dans les expériences préliminaires pour améliorer sa stabilité et/ou son caractère lipophile afin d'accroître sa pénétration à travers la membrane cellulaire. Deux autres séries seront développées pour mimer des états de transition et des analogues stables de nucléosides. L'affinité de ces nouveaux inhibiteurs pour leurs cibles purifiées respectives sera testée. Dans la tâche 3, les inhibiteurs présentant les meilleures propriétés in vitro seront testés sur des souches sauvages des 5 agents pathogènes. Les CMI et survies seront déterminées avec les antibiotiques les plus efficaces définis en tâche 1. La comparaison avec les résultats des mutants de D-alanylation permettra d'évaluer dans quelle mesure les nouveaux médicaments retranscrivent les sensibilités aux antibiotiques de ces souches. Les molécules présentant les meilleurs rendements in vivo seront testées pour leur pénétration, leur stabilité (biofluides et extraits cellulaires) et leur capacité à inhiber la D-alanylation. Les principaux inhibiteurs seront produits à une plus grande échelle pour mener à bien la tâche 4. Celle-ci consistera à évaluer la capacité des nouveaux médicaments adjuvants à sauver les animaux ou empêcher leur colonisation après une infection par les 5 agents pathogènes. Deux modèles seront utilisés, le modèle d'insecte Galleria mellonella et des souris. Les expériences sur souris donneront également les premières indications sur la toxicité des inhibiteurs chimiques chez les mammifères. Enfin, l'impact des nouveaux médicaments sur le microbiote de souris sera évalué par analyse de l'ARN 16S.
Les résultats de ce projet présenteront un intérêt fondamental et appliqué. Ils aideront à comprendre comment l'absence de D-alanylation rétablit la sensibilité aux ß-lactames chez les bactéries résistantes. De plus, ce projet pourrait devenir un projet de recherche translationnelle, car les nouveaux médicaments adjuvants pourraient être valorisés par le dépôt de brevets et par l’introduction dans un processus de maturation permettant d'évaluer leurs applications cliniques.