Microbiome "toxique" et progression de la maladie rénale chronique. Une étude prospective – CKD_Microbiome

Le projet CKD_Microbiome est une étude ancillaire à l'étude nationale prospective CKD-REIN, qui a inclus des patients atteints de MRC (stades 2 à 5), représentatifs au niveau national, provenant de 40 centres de néphrologie en France. Un total de 240 patients ont fourni des échantillons de selles, accompagnés de prélèvements sanguins et urinaires (T0). Les patients ont également rempli des questionnaires généraux ainsi qu’un questionnaire de fréquence alimentaire. Parmi eux, 103 patients ont fourni un second ensemble de prélèvements trois ans plus tard (T1).

À partir des échantillons de selles, l'ADN bactérien a été extrait et séquencé par séquençage métagénomique shotgun. Les séquences obtenues ont été comparées au catalogue de gènes "Integrated Gut Catalogue 2 (IGC2)" et au catalogue du microbiome oral humain. Des "pangénomes d'espèces métagénomiques (MSP)" ont été extraits de ces catalogues.

Dans les échantillons de sang, 10 toxines urémiques et 3 précurseurs ont été mesurés à T0 et T1 via UHPLC-MS/MS.

Des analyses statistiques ont été menées pour répondre aux objectifs définis. La comparaison entre les patients atteints de MRC et les individus sains a été réalisée en utilisant les cohortes CKD-REIN et "Milieu Intérieur". Les indices de diversité (alpha et bêta), ainsi que le Gut Microbiome Health Index (GMHI), ont été comparés dans les trois premiers objectifs, ainsi que la composition du microbiote. La sévérité de la MRC a été définie comme suit : modérée (n=130, DFGe ≥ 30 mL/min/1,73 m²) et sévère (n=110, DFGe < 30 mL/min/1,73 m²). La progression de la MRC a été caractérisée par un déclin supérieur à 30 %, le recours à un traitement de suppléance, ou le décès : 68 progresseurs rapides et 172 progresseurs lents ont été identifiés. Des analyses de Cliff's delta ont été effectuées pour identifier les espèces les plus discriminantes entre les groupes. Une intégration multi-omics a été réalisée avec le modèle "Data Integration Analysis for Biomarker discovery using Latent cOmponents (DIABLO)".

Concernant la partie expérimentale, 10 patients atteints de MRC issus de l’étude CKD_Microbiome et 10 volontaires sains ont été sélectionnés comme donneurs et ont fourni des échantillons de selles fraîches. Les échantillons ont été regroupés pour la transplantation de microbiote fécal (TMF) sous forme de suspension fécale mixte, administrée par gavage oral à des souris préalablement traitées aux antibiotiques pendant trois jours consécutifs. Le processus de gavage a été répété toutes les deux semaines. Les souris ont été sacrifiées deux semaines après le début de la TMF. Des échantillons de selles, de sang et de tissus ont été collectés, les concentrations d'urée ont été mesurées, et le séquençage bactérien de l’ARNr 16S dans le cæcum a été effectué pour analyser le microbiote intestinal.

Nos résultats montrent que le microbiote intestinal évolue progressivement au cours de la maladie rénale chronique (MRC) :

L'indice de santé du microbiote (GHMI) tend à être plus faible chez les patients atteints de MRC par rapport aux contrôles sains. Nous avons identifié environ 10 % du microbiome total comme étant significativement différent entre ces deux populations. Les espèces enrichies chez les patients MRC appartenaient principalement aux genres Enterocloster et Hungatella (famille des Lachnospiraceae), avec une tendance à une plus grande abondance d'espèces productrices de toxines urémiques (TU).

En ce qui concerne la sévérité de la maladie, bien que les indices de diversité et le GHMI ne diffèrent pas significativement entre les groupes, la composition du microbiote diffère, avec une augmentation marquée des espèces productrices de toxines chez les patients atteints de MRC sévère par rapport à ceux avec une MRC modérée. Des analyses de corrélation montrent que ces espèces enrichies chez les patients sévères sont fortement corrélées aux concentrations sanguines de TU.

Grâce à des modèles multi-omiques intégrés, nous avons identifier des marqueurs différenciant les patients selon la sévérité de la MRC :

Les espèces enrichies dans le groupe sévère incluent D. fairfieldensis msp_0295, Bacteroides clarus msp_0063 et Blautia obeum msp_0722, qui abritent des gènes essentiels à la production de toxines urémiques. De plus, les patients atteints de MRC sévère se distinguaient par des habitudes alimentaires spécifiques, notamment une consommation relativement élevée d'alcool et de boissons chaudes, ainsi que par des caractéristiques cliniques telles que l'inflammation et des niveaux sanguins accrus de plusieurs TU.

Nous avons également identifier des marqueurs différenciant les progresseurs lents des progresseurs rapides :

Plusieurs espèces productrices de TU, comme D. bacterium_MSP 226 et Alistipes putredinis_MSP 0090, étaient significativement plus abondantes chez les progresseurs rapides. À l'inverse, F. prausnitzii 4_msp0389 était associée à une progression plus lente de la MRC. Les niveaux élevés de toxines urémiques dans le sang et la présence d'albuminurie étaient également corrélés à une progression plus rapide de la maladie.

Après 3 ans, la composition du microbiote intestinal a été altérée, avec une perte significative de la richesse bactérienne et une augmentation des espèces productrices de TU, ce qui s'accompagnait d'une hausse des concentrations sanguines en toxines urémiques. Cependant, le ratio des espèces productrices de toxines par rapport aux espèces totales a diminué chez les patients consommant des probiotiques, augmentant leur consommation de légumes ou réduisant leur apport en protéines.

Enfin, la partie expérimentale a démontré que la transplantation de microbiote fécal (TMF) provenant de patients atteints de MRC chez des souris a induit un début de fibrose rénale et une augmentation des TU.

Notre projet apporte de nouvelles perspectives sur le lien entre le microbiome intestinal, les toxines urémiques et l'alimentation. Notre étude souligne le rôle crucial du microbiome et de ses métabolites dans la maladie rénale chronique (MRC), suggérant que le microbiome représente une cible thérapeutique potentielle pour ralentir la progression de la MRC. Plus précisément, nous avons identifié certaines espèces bactériennes impliquées dans la production de toxines urémiques (TU), qui pourraient être ciblées dans de futurs essais cliniques. Réduire ces espèces pourrait constituer une stratégie prometteuse pour atténuer la progression de la MRC. De plus, nos résultats indiquent que des modifications alimentaires—comme la réduction de l'apport en protéines, l'augmentation de la consommation de légumes ou la prise de probiotiques—peuvent influencer la composition du microbiote intestinal. Cela ouvre de nouvelles perspectives pour des essais cliniques, où des changements alimentaires ou une supplémentation en probiotiques pourraient être explorés comme stratégies pour améliorer la santé du microbiote intestinal, limiter la production de TU et ralentir la progression de la MRC.

La maladie rénale chronique (MRC) affecte 10 à 15% des adultes et est associée à un risque élevé de progression vers l’insuffisance rénale terminale, de maladie cardiovasculaire et de mortalité. Peu de traitements sont disponibles pour ralentir la progression de la MRC et réduire ses complications. L'intérêt pour la composition du microbiote intestinal dans la MRC a surgi en raison de son rôle dans la production des toxines urémiques. La fermentation des protéines alimentaires par le microbiote intestinal conduit à la production de déchets métaboliques, appelés toxines urémiques, normalement éliminées par les reins. Ces toxines favorisent la progression de la MRC, l’insulino-résistance et l’inflammation. Cependant, les relations entre les caractéristiques du microbiote intestinal, la production de toxines urémiques et la progression de la MRC n’ont jamais été explorées prospectivement chez l’homme. L’objectif général du projet CKD_Microbiome est d’étudier le rôle et les mécanismes de la toxicité liée au microbiote intestinal dans la progression de la MRC et l’impact potentiel du régime alimentaire sur cette relation. Il inclut un volet observationnel et un volet expérimental.
Le volet observationnel du projet est une étude ancillaire de la cohorte CKD-REIN, qui a inclus 3033 patients adultes avec une MRC stades 3-5 (débit de filtration glomérulaire estimé [DFGe] < 60 mL/min/1.73m²) dans 40 consultations de néphrologie représentatives nationalement entre 01/2014 et 03/2016. Le suivi des patients est en cours et durera 5 ans, avec un recueil annuel de données cliniques et biologiques. L’étude CKD_Microbiome est basée sur un sous-échantillon de 240 patients avec un recueil simultané d’échantillons de sang et de selles, deux fois à 3 ans d'intervalle - aux suivis à 2 ans et 5 ans - ainsi que de données sur l’alimentation. Des protocoles standardisés seront utilisés pour extraire et séquencer l’ADN à partir des échantillons de selles, et déterminer la présence et l’abondance de chaque espèce microbienne et leur fonctionnalité pour tous les échantillons. En parallèle, les toxines urémiques liées et non liées aux protéines seront mesurées dans le sang. Grâce à ces échantillons uniques, nous pourrons étudier les relations transversales et longitudinales entre la composition et les fonctionnalités du microbiote et le niveau de fonction rénale et la vitesse de son déclin sur 3 ans, pour tester l’hypothèse (objectif primaire) selon laquelle le microbiote intestinal aggrave la progression de la MRC par la production de précurseurs des toxines urémiques. Ce volet observationnel évaluera également l’effet modulateur potentiel des profils alimentaires sur ces relations (objectif secondaire).
Dans le volet expérimental du projet, nous explorerons la causalité de la relation entre les espèces microbiennes identifiées et la production de toxines urémiques en étudiant l’impact de la transplantation de microbiote fécal de patients avec des niveaux élevés vs bas de toxines urémiques chez des souris traitées sur leur production de toxines urémiques.
Le consortium CKD_Microbiome réunit 5 équipes complémentaires apportant les expertises en métagénomique et bioinformatique (SD Ehrlich, INRA), analyse des toxines urémiques (JC Alvarez, ZA Massy, UVSQ), épidémiologie et biostatistique (B Stengel, INSERM U1018, S Wagner, CIC, SD Ehrlich, INRA U1367), nutrition (S Wagner, CIC, D Fouque, INSERM U1060), néphrologie et recherche expérimentale (L Koppe, D Fouque, INSERM U1060), ainsi que les capacités opérationnelles nécessaires pour mener à bien ce projet.
Le projet CKD_Microbiome ouvrira de nouvelles pistes conceptuelles et mécanistiques, basées sur les tests du microbiome ‘toxique’ développés chez l’animal, et améliorera la compréhension de la toxité du microbiote dans la MRC. Il permettra d'identifier de nouveaux biomarqueurs de progression de la MRC et de concevoir des interventions visant à modifier le microbiote pour diminuer sa toxicité.