CE14 - Physiologie et physiopathologie

Impact des interactions cellulo-matricielles anormales dans progression des hépatopathies métaboliques – MATRIXNASH

Impact des interactions cellulo-matricielles anormales dans la progression des hépatopathies métaboliques

Les hépatopathies métaboliques (NAFLD)(25% de prévalence mondiale) sont les causes majeures de morbi-mortalité. L'inflammation chronique (NASH) et la fibrose associée sont les formes progressives des NAFLD et aucun traitement pharmacologique n'est encore disponible. Nous étudierons comment la matrice extracellulaire et ses récepteurs jouent un rôle clé dans l'orchestration de l'inflammation chronique et la fibrose contribuant à la progression des NAFLD.

Nous étudierons le rôle combiné de la tenascin-C, Hyaluronan et CD44 (surexprimés dans la NAFLD chez homme et la souris) pour identifier de nouveaux outils diagnostics et stratégies thérapeutiques.

TÂCHE 1 : Déchiffrer les voies dépendantes de l'ECM favorisant le développement et la progression de la NAFLD dans différents modèles murins imitant la NAFLD : se concentrer sur un axe de signalisation CD44-OPN-HA-TNC. En utilisant des modèles murins de NAFLD avec des niveaux modifiés de certains candidats (par exemple CD44, OPN, TNC), nous déterminerons les rôles de chaque candidat individuellement et en relation avec les autres. Ces effets peuvent être spécifiques au type de cellule : <br />Tâche 1.1 : cibler l'expression de CD44 : invalidation globale et cellule spécifique (myéloïde, lymphoïde et dans les LSEC) de CD44 chez la souris. <br />Tâche 1.2 : cibler l'expression de TNC : souris soit invalidée pour TNC soit surexpression la TNC dans le foie chez des souris sauvages ou CD44 KO. <br />Tâche 1.3 : par des approches cellulaires, nous déterminerons les rôles spécifiques des voies CD44 et TNC dans les cellules immunitaires (cellules myéloïdes et lymphoïdes), les cellules stellaires hépatiques et les cellules endothéliales sinusoïdales du foie. <br /><br />TÂCHE 2 : établir un nouveau ciblage thérapeutique de l'axe CD44-OPN-HA-TNC. Sur la base de nos connaissances actuelles, nous ciblerons chaque candidat ou plusieurs candidats en combinaison par des approches générales ou spécifiques à un type de cellule hépatique et nous étudierons l'impact sur la NASH fibrosante. <br />Tâche 2.1 en ciblant CD44, CD44 ligand et TNC. <br />Tâche 2.2 : Par des approches AAV, nous ciblerons CD44 et/ou TNC dans les macrophages/monocytes, les cellules T, les cellules stellaires et les LSEC chez les souris développant une NASH fibrosante.<br /><br />TÂCHE 3 : De la paillasse au lit du patient : établir la pertinence chez homme par une approche intégrative. <br />Tâche 3.1 : Nous déterminerons la pertinence des cibles identifiées chez la souris chez l’homme. <br />Tâche 3.2 : Nous déterminerons la composition de l'MEC et du complexe CD44 en fonction de la sévérité de la NAFLD par des approches protéomiques et RNAseq sur des tissus/cellules humains. Nous validerons ensuite les candidats sélectionnés par des approches LOF et GOF dans des cultures cellulaires et des modèles de souris. L'expression des candidats sera étudiée dans une grande cohorte de patients obèses (n=1006).

Le consortium utilisera une approche pluridisciplinaire combinant «proteomics«, souris transgéniques, des nouvelles approches ciblant CD44 et une large cohorte d'échantillons humains pour une mieux comprendre la progression des NAFLD vers des hépatopathies sévères.

Résultats à 18 mois :

Étude de l'axe CD44-OPN-HA-TNC en ciblant CD44 chez la souris. Nous avons déjà généré des souris invalidées pour CD44 spécifiquement dans les cellules myéloïdes, lymphoïdes, endothéliales et stellaires. La spécificité de ces invalidations a déjà été évaluée et les souris seront soumises à différents régimes alimentaires induisant de la NAFLD.

Étude de l'axe CD44-OPN-HA-TNC en ciblant TNC chez les souris. Des souris invalidées pour TNC ou sur exprimant la TNC dans le foie (système inductible) ont été générées. Les souris obtenues sont actuellement analysées et seront ensuite utilisées dans des protocoles de NAFLD.

Évaluation du profil « protéomique ». Les expériences sont en cours; un ensemble de données de référence à grande échelle a été établi, représentant les altérations protéomiques interindividuelles (n > 90) ainsi que les altérations protéomiques quantitatives définies.

Etude de l'axe CD44-OPN-HA-TNC dans les cellules. Nos résultats préliminaires indiquent que CD44 pourrait réguler les fonctions des cellules immunitaires (macrophages et neutrophiles). CD44 pourrait favorisait l'activation de la tyrosine kinase cytoplasmique SYK en réponse au LPS. Comme nous avons récemment rapporté que cette voie joue un rôle critique dans la stéatohépatite en régulant les fonctions des macrophages, la voie SYK dépendante du CD44 sera étudiée plus en détail. Parallèlement, nous avons démontré que l'activation de la lignée humaine de cellules stellaires était associée à l’augmentation de l’expression de CD44 et de TNC. La TNC exogène augmente aussi l'expression des marqueurs de fibrose et de CD44. Le dialogue entre CD44 et TNC dans ce processus sera étudiée.

Évaluation chez les souris avec une NAFLD l'impact thérapeutique du ciblage de la voie CD44-OPN-HA-TNC. Nous développons des AAV synthétiques capables de cibler spécifiquement les macrophages, les cellules T, les cellules endothéliales et les cellules stellaires hépatiques. L'approche in vivo couplée à la validation ex-vivo a déjà permis de sélectionner plusieurs candidats AAV. Les prochaines étapes seront l'établissement de vecteurs AAV codant pour un shRNA CD44, un shRNA TNC ou les deux afin de diminuer l'expression de CD44 et/ou TNC dans des cellules hépatiques spécifiques.

Étude de la pertinence des voies CD44-OPN-HA-TNC dans le foie de patients NAFLD. Nous avons précédemment rapporté que CD44 est un marqueur hépatique de la NASH chez les patients obèses. L'expression hépatique des TNC sera évaluée en fonction de la sévérité de la NAFLD et corrélée à l'expression de CD44. De plus, des résultats préliminaires semblent indiquer que la sévérité de la NASH est associée à l'expression de novo de variants de CD44 dans un modèle murin de NAFLD. Cette expression semble davantage liée à la fibrose hépatique. Les prochaines étapes consisteront à déterminer quelles cellules hépatiques expriment ces variants de CD44 et à évaluer leur pertinence chez l'homme.

Dans les prochains mois, nos objectifs seront

Étudier l'axe CD44-OPN-HA-TNC en ciblant CD44 chez la souris. Des souris invalidées pour CD44 spécifiquement dans les cellules myéloïdes, lymphoïdes, endothéliales et stellaires seront soumises à différents régimes induisant de la NAFLD. Le profil « protéomique » hépatique sera évalué.

Étudier l'axe CD44-OPN-HA-TNC en ciblant la TNC chez les souris. Les souris invalidées pour TNC ou surexprimant TNC au niveau du foie (système inductible) seront soumises à différents régimes induisant de la NAFLD. Le profil « protéomique » hépatique sera évalué.

Étudier l'axe CD44-OPN-HA-TNC dans les cellules. Le rôle du CD44 dans la régulation des fonctions des macrophages et des neutrophiles sera étudié plus en détail (en se concentrant sur le métabolisme, les tyrosine kinases cytoplasmiques, les réponses biologiques........). Le dialogue entre CD44 et TNC dans la régulation des fonctions des cellules stellaires sera étudié en parallèle.

Évaluer chez les souris NAFLD l'impact thérapeutique du ciblage de la voie CD44-OPN-HA-TNC. Les prochaines étapes seront l'établissement de vecteurs AAV codant pour un shRNA CD44, shRNA TNC ou les deux afin de diminuer l’expression de CD44 et/ou TNC dans des cellules hépatiques spécifiques. Nous évaluerons ensuite l'impact de cette régulation négative de CD44 et/ou TNC dans un type de cellules hépatiques sur le développement et la correction de la NAFLD.

Pertinence des voies CD44-OPN-HA-TNC chez homme. Les prochaines étapes consisteront à évaluer l’expression des variants de CD44 et de la TNC sur des biopsies hépatiques humaines en fonction de la sévérité de la NAFLD.

Publications at 18 months related to the project (ANR-19-CE14-0044 and DFG: GR 4553/5-1)

ARTICLES

1: Luci C #, Vieira E #, Bourinet M, Rousseau D, Bonnafous S, Patouraux S, Lefevre L, Larbret F, Prod'homme V, Iannelli A, Tran A, Anty R, Bailly-Maitre B, Deckert M $, Gual P $. 3BP2-SYK pathway activity in parenchymal and myeloid cells is a key pathogenic factor in non-alcoholic steatohepatitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2021, S2352-345X(21)00171-5. doi: 10.1016/j.jcmgh.2021.08.004. (Team 1)

2: Fahrner M, Kook L, Fröhlich K, Biniossek ML, Schilling O. A Systematic Evaluation of Semispecific Peptide Search Parameter Enables Identification of Previously Undescribed N-Terminal Peptides and Conserved Proteolytic Processing in Cancer Cell Lines. Proteomes. 2021 May 25; 9(2):26. doi: 10.3390/proteomes9020026. (Team 5)

REVIEWS

3: Luci C, Bourinet M, Leclère PS, Anty R, Gual P. Chronic inflammation in non-alcoholic steatohepatitis: molecular mechanisms and therapeutic strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11:597648. doi: 10.3389/fendo.2020.597648. (Team 1)

Les hépatopathies métaboliques (NAFLD), avec une prévalence mondiale de 25 %, sont des causes majeures de morbi-mortalité. Aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible pour diminuer l’inflammation hépatique chronique (stéatohépatite (NASH)) ou la fibrose associée qui sont les formes progressives des NAFLD. Bien que les mécanismes qui sous-tendent la progression du NAFLD ne soient pas entièrement compris, l’inflammation chronique est un acteur clé qui induit un dysfonctionnement hépatique, des tissus adipeux et de l’intestin. L’inflammation chronique modifie la tolérance physiologique hépatique et favorise la souffrance et la fibrogénèse hépatiques. La matrice extracellulaire (MEC) et ses récepteurs jouent un rôle clé dans l’orchestration de l’inflammation chronique (foie, tissu adipeux) et de la fibrose hépatique qui favorisent la NASH fibrosante. La signalisation par CD44 (glycoprotéine de surface cellulaire) est initiée par les molécules de la MEC (ostéopontine (OPN), hyaluronan (HA), et indirectement ténascine-C (TNC)) qui peuvent renforcer l’intensité et la chronicité du signal. OPN, HA, TNC et CD44 peuvent former des complexes avec des récepteurs membranaires (comme c-Met, VEGFR, TLR4, EGFR, CXCR4….) qui sont connus pour réguler l’inflammation, l’angiogenèse et la fibrogenèse. Nous proposons que le CD44 agisse comme un intégrateur central et potentialisateur de la transmission des signaux de la MEC vers le cytoplasme, déclenchant ainsi une signalisation pro-inflammatoire qui favoriserait le développement des NAFLD.

En effet, le consortium a déjà mis en évidence que le ciblage de CD44 atténue fortement la souffrance hépatique, la stéatohépatite et la fibrose hépatique associées à une diminution du recrutement hépatique des macrophages et des neutrophiles, des niveaux OPN et de la signalisation de la TNC. Chez les patients, les expressions hépatiques de CD44 et TNC sont fortement corrélées entre elles et avec l’enrichissement/le contenu hépatique en macrophages suggérant une action combinée des deux molécules dans le NAFLD.

Les objectifs de MATRIXNASH sont de :
1.-Décrypter les voies dépendantes de l’ECM favorisant le développement et la progression des NAFLD par des approches protéomiques et génomiques dans des modèles murins de NAFLD et avec des niveaux d’expression modifiée (invalidation et surexpression) de nos protéines candidates (càd CD44, OPN, TNC).
2.-Établir de nouvelles stratégies thérapeutiques dans nos modèles de NASH-fibrosante en ciblant nos candidats (CD44, TNC) seuls ou en combinaison par des approches globales ou des cellules hépatiques spécifiques via la technologie des AAVs.
3.-Établir la pertinence humaine par une approche intégrative (cohorte de 1006 patients obèses). Nous acquerrons des connaissances complètes sur la composition de la MEC et de CD44 dans la NAFLD humaine par des approches protéomiques et génomiques et l’analyse des acteurs identifiés chez nos modèles murins Les nouveaux candidats les plus pertinents pour la maladie humaine, seront validés et étudiés dans des études cellulaires et nos modèles murins de NAFLD.

Le consortium utilisera donc des approches multidisciplinaires communes combinant la protéomique, des souris transgéniques, des nouveaux ciblages thérapeutiques du CD44 et de la TNC et d’une grande cohorte d’échantillons humains pour une meilleure compréhension de l’étiopathologie du développement et la progression des NAFLD. Ces résultats pourront fournir de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutique de la NAFLD.

Coordination du projet

Philippe GUAL (CENTRE MEDITERRANEEN DE MEDECINE MOLECULAIRE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

C3M CENTRE MEDITERRANEEN DE MEDECINE MOLECULAIRE
IRM IMMUNO-RHUMATOLOGIE MOLÉCULAIRE (UMR_S 1109)
KIT Karlsruhe Institute of Technology / KIT
UKHD Heidelberg University Hospital / Department of Infectious Diseases/Virology
ULK-FR DegraLab Institute of Surgical Pathology / Faculty of Medicine - University of Freiburg

Aide de l'ANR 497 630 euros
Début et durée du projet scientifique : mars 2020 - 36 Mois

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