Autophagie, proteases et performances agronomiques – hAPPEN

L’approche choisie pour l’étude mécanistique et physiologique de l’autophagie et des protéases associée est une approche de génétique réverse utilisant des plantes dans lesquelles les fonctions de l’autophagie et des protéases sont abolies par mutation ou bien sont stimulées par modification génétique.

Les phénotypes de ces plantes inhibées ou stimulées sont comparés à ceux de la plante sauvage qui sert de référence. Les phénotypes étudiés se situent à différentes échelles. Au niveau plante entière des analyses de flux d’azote sont réalisés par marquage isotopique, les biomasses sont mesurées et le niveau de sénescence foliaire est évalué au cours du développement.

L’imagerie par microscopie permet d’évaluer les modifications structurales engendrées par des défauts ou excès d’autophagie et protéases. Elle permet également de visualiser l’activité autophagique par la numération des vésicules d’autophagie.

Les modifications en contenus protéiques sont évaluées par des analyses de protéomique, les impacts sur le métabolisme par des approches de métabolomique.

Le projet hAPPEN a permis de montrer que les différentes protéases induites au cours de la sénescence et suspectées pour leurs rôles dans le recyclage nutritionnel n’étaient pas individuellement indispensables, car sans doute redondantes. Lorsque l’une d’elle est absente, son manque peut être compensé par une autre. A contrario, l’autophagie est absolument essentielle au recyclage et à la remobilisation de l’azote vers la graine, et les mutants d’autophagie montrent un déficit de remobilisation pouvant aller jusqu’à une réduction de 60% par rapport à la plante sauvage. Le projet a également permis de montrer qu’une stimulation de l’autophagie augmentait significativement les flux d’azote remobilisé vers la graine et permettait d’obtenir une augmentation du taux de protéines dans la graine. Ces résultats montrent donc que l’autophagie cellulaire est un levier pour l’augmentation du recyclage de l’azote, favorable à la réduction des intrants azotés.

Le projet hAPPEN a également permis de monter que les ressources protéiques dans les racines des plantes ne sont pas négligeables pour la remobilisation de l’azote vers le grain. Ce projet a permis de disséquer et caractériser les évènements métaboliques se mettant en place dans les racines lors de leur vieillissement, et d’identifier les évènements majeurs pouvant avoir un effet sur les flux d’azote. Le projet a également permis d’étudier les défauts racinaires des mutants d’autophagie et d’établir un lien entre le mécanisme d’autophagie racinaire et la gestion des flux d’eau dans la plante.

Enfin le projet hAPPEN a permis d’identifier des partenaires protéiques qui pourraient participer à la machinerie autophagique, ce qui doit maintenant être étudié.

Les perspectives du projet hAPPEN sont (i) la recherche de mécanismes de régulation des flux d'azote au niveau plante entière, (ii) la recherche de facteurs de régulation de l'activité autophagique pouvant servir de biostimulant du recyclage nutritionnel, et (iii) la dissection fine du rôle des nouveaux partenaires de potentiels l’autophagie identifiés dans hAPPEN.

Le projet hAPPEN est un projet de recherche fondamentale de 48 mois, coordonné par l’Institut Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (INRAE), avec pour partenaire l’unité EVA de l’Université Caen Basse Normandie. Ce projet a commencé en janvier 2020 et a duré 5 ans. Il a bénéficié d’une aide ANR de 463 265 € pour un coût global de 522 264 €.

L’utilisation d’engrais azotés est responsable du rejet d'oxyde nitreux et de la pollution de l'eau. Il serait possible de réduire l'utilisation des engrais sans nuire aux rendements ni à la qualité des produits végétaux en augmentant les performances de recyclage des éléments nutritifs des plantes et la remobilisation de l'azote d’organe à organe. La sénescence des feuilles est un processus de développement bien connu pour son importance dans la gestion des ressources au niveau plante entière. Au cours de la sénescence, la dégradation séquentielle des composants cellulaires est régulée et coordonnée de manière chronologique afin de recycler les nutriments et de procéder à la remobilisation vers les puits. Les chloroplastes sont les premiers organites à être démantelés et la principale source d'azote dans les protéines des feuilles.
De manière surprenante, la plupart des protéases associées à la sénescence foliaire sont situées dans des vacuoles lytiques. Parmi celles-ci, on peut citer SAG12 (gène 12 associé à la sénescence), RD21 et Cathepsine B qui sont des protéases à cystéine, et la protéase à aspartate AED1. Rien n’est su du rôle de ces protéases dans le recyclage et la remobilisation de l'azote, sauf dans le cas de SAG12 récemment publié. La chronologie de l'expression et de la maturation des différentes protéases et leurs localisations dans les compartiments cellulaires sont clairement des mécanismes stratégiques pour le contrôle des processus cataboliques dont dépend le début et la durée de la sénescence des feuilles.
La dégradation des protéines du stroma du chloroplaste a été étudiée depuis longtemps. La première étape serait une fragmentation des protéines du stroma après oxydation en présence d'espèces réactives de l'oxygène. Les produits de fragmentation persistent probablement dans le chloroplaste jusqu'à ce qu'ils soient expulsés via les stromules dans les vésicules, appelées RuBisCO containing bodies(RCB) et dans des vacuoles associées à la sénescence (SAV) contenant la protéase de cystéine SAG12 entre autre. Il a été démontré que le trafic de RCB vers la vacuole lytique centrale nécessite la macro-autophagie. Ainsi, protéase et autophagie coopèrent dans la degradation des protéines chloroplastes et le recyclage des acides aminés qui les composent.
Les deux groupes de l'IJPB (groupe SATURNE) et de l'UMR INRA-UniCaen EVA impliqués dans ce projet ont montré que:
(i) L'autophagie et la protéase de cystéine SAG12 peuvent contrôler la mobilisation des éléments nutritifs pour un remplissage efficace des graines;
(ii) la surexpression de l'autophagie chez Arabidopsis peut améliorer le recyclage des éléments nutritifs et la mobilisation vers les graines;
(iii) SAG12 est exprimée de manière inattendue dans les racines d'Arabidopsis, où elle contrôle les flux d'azote de la racine aux graines et favorise ainsi leur remplissage lorsque les plantes sont en manque d'azote;
(iv) Le rôle de SAG12 dans les feuilles au cours de la sénescence est essentiel pour la mobilisation de l'azote des feuilles et l'expression de SAG12 dans les feuilles sénescentes, ainsi que dans les racines au stade de la reproduction, suggère que cette protease participe à la signalisation source-puits;
(v) Plusieurs protéines accumulées spécifiquement dans les mutants d’autophagie pourraient être des cibles spécifiques de l’autophagie, comme le suggère la présence de motifs AIM dans leurs séquences et leurs réseaux de régulation de gènes.
Les résultats obtenus suggèrent que des effets de compensation existent entre les différentes protéases et la voie de l'autophagie, facilitant une mobilisation efficace des éléments nutritifs.
L'objectif du projet est d'étudier les rôles complémentaires de l'autophagie et des protéases dans la mobilisation des éléments et dans la signalisation source-puits en particulier lors de la sénescence des feuilles et des racines.