CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonction des macromolécules biologiques

Structure et fonction moléculaire du pseudopilus dans la sécrétion de protéines par lla voiè de type 2 – SYNERGY_T2SS

Structure et fonction moléculaire du pseudopilus dans la voie de sécrétion de type II chez les bactéries

Synergy_T2SS vise à déterminer la relation structure-fonction du pseudopilus, partie motrice du système de sécrétion de type II, chez trois bactéries modèles. Les modèles actuels de sécrétion – ‘piston’ et ‘vis d’Archimède’ – prédisent des différences au niveau de la dynamique du pseudopilus et de ses interactions avec le substrat sécrété. Par des approches intégratives, nous allons tester ces prédictions afin de proposer un modèle unifié de sécrétion de type II, validé expérimentalement.

Comprendre le mécanisme et la spécificité de sécrétion des enzymes lytiques et toxines bactériennes

De nombreuses bactéries à Gram-négatif possèdent dans leur enveloppe le système de sécrétion type II (SST2), une machine moléculaire qui leurs permet de larguer des protéines spécifiques dans le milieu de culture. Les protéines sécrétées sont souvent des enzymes lytiques et toxines impliquées dans la virulence, mais aussi des adhésines ou cytochromes permettant la respiration minérale. L’SST2 a la capacité de sécréter les protéines repliées sous forme native et active, et ce de manière hautement spécifique et efficace. Afin de comprendre ce mécanisme au niveau moléculaire, il est nécessaire de comprendre la structure du système et les interactions des protéines impliquées dans la mise en place de la machinerie de transport. Synergy_SST2 se focalise sur la partie dynamique d’SST2, le sous-complexe appelé pseudopilus, directement impliqué dans la reconnaissance et transport des substrats. Nos études structurales et fonctionnelles visent à tester les prédictions de deux modèles mécanistiques proposés pour décrire la fonction moléculaire d’SST2 (« piston » ou « vis d’Archimède »). Afin de trancher entre ces modèles, nous menons des études comparatives de la structure du pseudopilus dans trois bactéries modèles - Klebisella, Pseudomonas et Dickeya, - en intégrant les données fonctionnelles et structurales. Notre objectif est de caractériser les interactions entre le pseudopilus et les substrats spécifiques de chaque système in vitro et in vivo. Les résultats devraient permettre de comprendre la nature des motifs spécifiques jouant le rôle de signal de sécrétion. Le deuxième objectif est de déterminer la dynamique du pseudopilus ou niveau moléculaire. Les résultats de ces études devraient permettre de mieux comprendre les bases moléculaires de sécrétion et de proposer un modèle mécanistique validé expérimentalement. Ils pourraient également permettre à exploiter l’SST2 a des fins biotechnologiques ou thérapeutiques.

Le but de ce projet est de déterminer les me´canismes mole´culaires qui associent l’assemblage du pseudopilus a` la se´cre´tion des prote´ines par le SST2. Cet objectif ambitieux est a` pre´sent accessible gra^ce aux re´cents progre`s re´alise´s par les e´quipes partenaires de ce projet, dans la compre´hension de l’organisation structurale du pseudopilus et des exoprote´ines. Les six partenaires du consortium SYNERGY_T2SS s’appuieront sur leurs expertises tre`s comple´mentaires pour disse´quer ce me´canisme de se´cre´tion au niveau mole´culaire. Ainsi, trois experts de la biologie du SST2 chez diffe´rents pathoge`nes humains (P1, P2) et ve´ge´taux (P3) s’associeront a` trois biologistes structuraux, experts en RMN et analyse biochimique (P4), en mode´lisation structurale (P5) ainsi qu’en cryo-microscopie e´lectronique (Cryo-EM) (P6).
Dans un effort syste´matique et concerte´, nous déterminerons pour les trois modèles SST2, la structure atomique du pseudopilus natif incluant le corps (task 1) et le sommet (task 2), ses interactions avec les substrats (task 3) ainsi que sa dynamique in vivo et in silico (task 4). Nous souhaitons ainsi comprendre comment, a` l’e´chelle atomique, l’assemblage du pseudopilus induit la se´cre´tion du substrat gra^ce a` l’analyse structurale, biophysique et fonctionnelles des interactions entre le pseudopilus et un ensemble d’effecteurs se´lectionne´s. Enfin, nous tenterons de visualiser la dynamique du pseudopilus gra^ce a` la mise en œuvre de techniques re´centes de marquage fluorescent in vivo utilisant des fluorophores couple´s au male´imide. Cette approche qui sera associe´e a` une analyse in silico de la dynamique interne et globale du pseudopilus nous permettra de de´terminer si le pseudopilus se re´tracte ou s’assemble de manie`re permanente selon les deux mode`les actuellement propose´s.

Malgré le ralentissement dû à la crise sanitaire qui nous frappe, les travaux de la première année ont pu avancer. Trois publications originales mono-partenaires ont vu le jour, ainsi qu’une revue pluri-partenaire. Les travaux de P2 sur le pseudopilus Xcp de P. aeruginosa ont conduit au premier modèle atomique complet d’un pseudopilus SST2. Ce modèle montre le prolongement de chacun des quatre protofilaments du corps du pseudopilus (déjà résolus à l’échelle atomique par P1, P4 et P5) par une des quatre pseudopilines mineures, elles même organisées en un complexe quaternaire localisé au sommet du pseudopilus. Ce modèle s’accommode parfaitement à la cavité centrale de la sécrétine par laquelle le pseudopilus transite très probablement. Ces travaux qui font l’objet d’une publication actuellement en révision pour le journal « Structure » sont d’ores et déjà accessibles en « preprint » sur le site de « BioRxiv » (doi.org/10.1101/2020.12.11.420943).

P3 a publié les résultats mettant la lumière sur les mécanismes moléculaires mises en jeu pour la reconnaissance des protéines par le SST2 (10.1016/j.jbc.2021.100305). L’analyse structure-fonction des signaux de sécrétion portés par les exoprotéines de Dickeya et Pectobacterium a démontré que au lieu d’un élément structural particulier, quelques régions distantes et structurellement flexibles agissent ensemble comme un signal de sécrétion composite. Nous avons démontré qu'une de ces régions-clés subit des transitions de désordre à ordre ce que pourraient refléter sa structuration transitoire lors du recrutement par le SST2. Une telle structuration de quelques zones intrinsèquement désordonnées des exoprotéines induite par le SST2 pourrait faire partie du mécanisme général de leur recrutement par ce système de sécrétion.

P1 a participé à une étude collaborative mettant en évidence un système de sécrétion de type II dans les mitochondries chez plusieurs espèces de protozoaires unicellulaires (ordre Excavata).

Une meilleure compréhension du SST2 devrait nous permettre d'exploiter ce mode de sécrétion singulier pour de futures applications en vaccinologie, thérapie anti-microbienne, biologie synthétique et bio-rémédiation. Une telle compréhension nous permettra également d’envisager l’exploitation du SST2 pour la sécrétion de protéines nécessitant un repliement intracellulaires à très forte valeur ajoutée.

1. Structure and function of minor pilins of type IV pili.
Jacobsen T, Bardiaux B, Francetic O, Izadi-Pruneyre N, Nilges M. Med Microbiol Immunol. 2020 Jun;209(3):301-308. doi: 10.1007/s00430-019-00642-5.(P1, P4, P5)

2. Pineau, C., N.Guschinskaya, IR Gonc¸alves, F. Ruaudel, X. Robert, P.Gouet, L. Ballut, VE Shevchik . Structure–function analysis of pectate lyase Pel3 reveals essential facets of protein recognition by the bacterial type 2 secretion system. J Biol Chem. 2021 Jan 16;100305. doi: 10.1016/ j.jbc.2021.100305. (P3)

3. Analysis of diverse eukaryotes suggests the existence of an ancestral mitochondrial apparatus derived from the bacterial type II secretion system.« by L. Horváthová, V. Žárský, T. Pánek, R. Derelle, J. Pyrih, Al. Motycková, V. Klápštová, M. Vinopalová, L. Markova, L. Voleman, V. Klimeš, M. Petru, Z. Vaitová, I. Cepicka, K. Hryzáková, K. Harant, Mi. Gray, M. Chami, I. Guilvout, O. Francetic, B. F. Lang, C. Vlcek, A. Tsaousis, M. Elias, and P.Dolezal [Paper in press #NCOMMS-18-17107D. (P1)

4. Multidisciplinary Interrogation of a Crucial Protein Interface in the Type II Secretion System Escobar CA, Douzi B, G. Ball, B Barbat, S.A. Alphonse, L. Quinton, R. Voulhoux, KT Forest 2020.12.11.420943; BioRxiv preprint. doi: doi.org/10.1101/2020.12.11.420943. (P2)

Les systèmes de sécrétion sont des facteurs déterminants dans la capacité des bactéries à acquérir des nutriments, transformer ou coloniser leur niche ou encore affecter la santé de leur hôte. Le système de sécrétion de type 2 (SST2) est une nanomachine constituée de 12 protéines essentielles, formant un large complexe enchâssé dans l’enveloppe des bactéries gram négatives. Ce système sécrète sous forme repliée et parfois oligomérique de nombreuses exoprotéines de type toxines, enzymes dégradatives, adhésines ou cytochromes. Le mode de reconnaissance des substrats SST2 est conformationnel et nécessite l'assemblage d'une structure de type pilus appelée pseudopilus. Malgré de nombreuses études, les déterminants moléculaires ainsi que les différentes étapes de ce transport hautement spécifique sont toujours largement méconnus.
Deux modèles opposées de fonctionnement du SST2 de type continu et discontinu ont été proposés. Dans le modèle continu ou « vis d’Archimède », le pseudopilus est assemblé au niveau de la membrane interne puis dégradé à son extrémité, maintenant ainsi une longueur constante, à la manière d’un tapis roulant moléculaire. Dans ce modèle, les substrats se lient au corps du pseudopilus composé de la pseudopiline majeure GspG et dont l’assemblage en continu entraine l’effecteur hors de la cellule. Le modèle discontinu de type « piston » propose une reconnaissance des substrats par un complexe protéique localisé au sommet du pseudopilus et composé des quatre pseudopilines mineures GspH-I-J-K. Dans ce modèle, l'extension du pseudopilus qui entraîne les exoprotéines à travers la membrane externe jusqu'au milieu extracellulaire est suivie d'une rétraction qui réinitialise le système permettant ainsi le chargement d'un nouveau substrat.
Le but de ce projet est de déterminer les mécanismes moléculaires qui associent l’assemblage du pseudopilus à la sécrétion des protéines par le SST2. Cet objectif ambitieux est à présent accessible grâce aux récents progrès réalisés par les équipes partenaires de ce projet, dans la compréhension de l’organisation structurale du pseudopilus et des exoprotéines. Les six partenaires du consortium SYNERGY_T2SS s’appuieront sur leurs expertises très complémentaires pour disséquer ce mécanisme de sécrétion au niveau moléculaire. Ainsi, trois experts de la biologie du SST2 chez différents pathogènes humains (P1, P2) et végétaux (P3) s’associeront à trois biologistes structuraux, experts en RMN et analyse biochimique (P4), en modélisation structurale (P5) ainsi qu’en cryo-microscopie électronique (Cryo-EM) (P6).
Dans un effort systématique et concerté, nous déterminerons pour les trois modèles SST2, la structure atomique du pseudopilus natif incluant le corps (task 1) et le sommet (task 2), ses interactions avec les substrats (task 3) ainsi que sa dynamique in vivo et in silico (task 4). Nous souhaitons ainsi comprendre comment, à l’échelle atomique, l’assemblage du pseudopilus induit la sécrétion du substrat grâce à l’analyse structurale, biophysique et fonctionnelles des interactions entre le pseudopilus et un ensemble d’effecteurs sélectionnés. Enfin, nous tenterons de visualiser la dynamique du pseudopilus grâce à la mise en œuvre de techniques récentes de marquage fluorescent in vivo utilisant des fluorophores couplés au maléimide. Cette approche qui sera associée à une analyse in silico de la dynamique interne et globale du pseudopilus nous permettra de déterminer si le pseudopilus se rétracte ou s’assemble de manière permanente selon les deux modèles actuellement proposés.
Une meilleure compréhension du SST2 devrait nous permettre d'exploiter ce mode de sécrétion singulier pour de futures applications en vaccinologie, thérapie antimicrobienne, biologie synthétique et bio remédiation. Une telle compréhension nous permettra également d’envisager l’exploitation du SST2 pour la sécrétion de protéines nécessitant un repliement intracellulaires à très forte valeur ajoutée.

Coordination du projet

Olivera Francetic (INSTITUT PASTEUR)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

BIS INSTITUT PASTEUR
MAP -CNRS MICROBIOLOGIE, ADAPTATION ET PATHOGENIE
LCB Laboratoire de chimie bactérienne
University of Virginia / Egelman lab
IP INSTITUT PASTEUR
BSCM INSTITUT PASTEUR

Aide de l'ANR 644 817 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2019 - 48 Mois

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