Bases structurales des mécanismes de gyration et reverse gyration de l'ADN – CtrlAltGyr

Les ADN topoisomérases sont des enzymes essentielles impliquées dans les remaniements de l’ADN lors de la réplication, la transcription, la réparation, la recombinaison, la ségrégation des chromosomes et la stabilité des génomes. Si la plupart des topoisomérases relâchent les ADN surenroulés, la gyrase et la reverse gyrase sont les seules capables d’introduire des supertours dans l’ADN. La gyrase est présente chez toutes les bactéries et archaebactéries mésophiles alors que la reverse gyrase est présente chez tous les organismes hyperthermophiles. La gyrase introduit une coupure double brin transitoire dans l’ADN entraînant des supertours négatifs tandis que la reverse gyrase coupe un seul brin d’ADN pour produire des supertours positifs. Malgré ces différents mécanismes, elles possèdent deux domaines CAP et TOPRIM participant à la transestérification par une tyrosine catalytique conservée. Ces deux domaines sont associés à un domaine ATPase différent chez la gyrase et la reverse gyrase, soit un domaine GHKL ou hélicase SF2. L’hydrolyse de l’ATP par ces deux nanomachines conduit à un état énergétique élévé de l’ADN en transportant de façon unidirectionnelle un ADN à travers la coupure. Malgré leur importance, les déterminants moléculaires et la cinétique de cette réaction unidirectionnelle restent encore mal compris. L’objectif de ce projet est d’analyser et de quantifier la façon dont ces deux topoisomérases utilisent l’énergie d’hydrolyse de l’ATP pour catalyser les réactions de gyration et gyration inverse de l’ADN. Les données actuelles suggèrent que des changements de conformation des protéines et de l’ADN sont induits par des interactions dynamiques entre le domaine ATPase et celui de transestérification.
Malgré de nombreux travaux, la corrélation entre les étapes catalytiques enregistrées dans les études cinétiques et les conformations adoptées par les enzymes fait encore l’objet de spéculations. Cette corrélation est limitée par la disponibilité de structures 3D complètes représentant différents états conformationnels des complexes nucléoprotéiques sur des ADN de topologie complexe. Il est donc nécessaire d’analyser l'architecture de ces complexes sur des ADN avec une topologie définie et contrôlée. Pour atteindre cet objectif, la cinétique et l'interaction ADN-enzyme doivent être contrôlées pour bloquer les conformations les plus stables. À l'aide de pinces magnétiques, nous effectuerons des mesures cinétiques en molécule unique pour définir la combinaison de petites molécules qui mènera à l'état le plus stable des complexes nucléoprotéiques. L'utilisation de différents analogues de l'ATP et d’inhibiteurs ciblant la gyrase et le domaine TopoIA de la reverse gyrase, nous aidera à piéger des états du cycle catalytique. Nous déterminerons ensuite par cryo-microscopie électronique l'architecture 3D de la gyrase sur un croisement d'ADN et de la reverse gyrase sur un ADN double brin. Nous combinerons les mesures cinétiques avec l'analyse structurale des conformations des deux enzymes. Les pinces magnétiques permettront de quantifier en temps réel les changements conformationnels qui se produisent sur une seule molécule d'ADN tandis que, par l'analyse d'un grand nombre de particules uniques, la cryo-microscopie électronique permettra d'analyser les différentes conformations des topoisomérases en interaction avec l'ADN. Le caractère thermophile des enzymes que nous utilisons facilite la préparation des échantillons et l’acquisition de données sur leurs états conformationnels et catalytiques. Les données cinétiques et les reconstructions tridimensionnelles vont nous permettre de comprendre les déterminants moléculaires du couplage entre l’hydrolyse de l’ATP et la réaction de surenroulement. L’ensemble de ces données complémentaires nous donneront une vision intégrée et dynamique des mécanismes de gyration et gyration inverse.