La ligation thioacide / azide appliquée aux acides nucléiques comme nouvel outil pour la biologie chimique – TALAN

La mise en œuvre de la réaction de sulfo-click sur des acides nucléiques requiert le développement de nouvelles méthodes de dérivatisation des monomères nucléosidiques afin de les incorporer au sein de séquences oligonucléotidiques. Pour cela, nous ambitionnons 1) de réaliser la réaction de sulfo-click sur des nucléosides possédant une fonction thioacide 2) d’étendre l’applicabilité de la réaction de sulfo-click à la synthèse d’analogues originaux des dinucléotides cycliques (CDN) et à la mise en œuvre de réactions de bioconjugaison sur des ODN modifiés 3) de mettre en œuvre la réaction de sulfo-click sur matrice d’ADN 4) de mettre en place un procédé de détection des miRNA grâce à la réaction de sulfo-click sur matrice d’ADN. Ainsi, en développant la mise en œuvre de la réaction de sulfo-click dans le domaine des acides nucléiques, nous ambitionnons d’apporter à la communauté scientifique un nouvel outil permettant de réaliser des réactions de bioconjugaison efficaces, complémentaire aux réactions déjà utilisées. Enfin, la mise en œuvre de cette réaction sur matrice d’ADN permettra la mise au point d’une nouvelle méthode efficace de détection des miRNA dans des milieux biologiques.

Nous avons tout d’abord concentré nos efforts sur la fonctionnalisation en position 4’ de différents nucléosides avec la fonction thioacide afin de pouvoir étudier la réaction de sulfo-click sur des nucléosides modifiés. Cela a pu être réalisé sur la thymidine, la cytidine et la guanosine en série désoxyribonucléotide mais aussi sur l’uracile en série ribonucléotide. Plusieurs molécules d’intérêt ont pu être fonctionnalisées avec la fonction sulfonyl azide et la réaction de sulfo-click a pu être mise en œuvre. La cinétique de la réaction a été étudiée, démontrant son intérêt pour des applications de bioconjugaison en milieu aqueux (k ~ 2.0 × 10-1 M-1s-1 à 25°C).
Ces résultats ont été publiés en 2020 dans le journal Org. Lett. et ont été remarqués dans la revue Synfacts au cours de la même année. De plus, nous avons été sollicités par un éditeur du journal Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. pour publier les protocoles détaillés de ces travaux.
Parmi les différentes structures d'acides nucléiques connues pour leurs applications médicales, les dinucléotides cycliques (CDN) émergent pour le ciblage de la protéine STING (Stimulator of interferon genes). Cette protéine est un élément clé dans le fonctionnement de la réponse immunitaire innée en stimulant la production d'interféron de type I, qui limitera l’infection d’un pathogène auprès des cellules voisines. Plusieurs recherches récentes ont montré l’important potentiel de la stimulation de la protéine STING par des CDN synthétiques. Ainsi nous avons commencé l’étude de la synthèse de CDN originaux possédant d’une part un lien internucléosidique N-acylsulfonamide et d’autre part un lien phosphate ou phosphorothioate. Bien qu’ayant rencontré de nombreuses difficultés induites par la présence du lien N-acylsulfonamide, nous sommes parvenu récemment à obtenir un premier CDN.

Au cours des prochains mois, notre objectif est d’avancer et éventuellement terminer les travaux concernant la synthèse de CDN originaux. De plus, envisageons d’incorporer le lien N-acylsulfonamide au sein de séquences oligonucléotidiques dont les propriétés seront étudiées (solubilité aqueuse, résistance aux nucléases, stabilité des duplexes formés avec un ODN complémentaire) pour des applications éventuelles dans le cadre des acides nucléiques thérapeutiques (i.e. ODN antisens, siRNA, aptamères). Une fois cela réalisé, nous prévoyons de commencer l’étude de l’incorporation des fonctions thioacide et/ou sulfonyl azide sur des ODN afin de synthétiser des bioconjugués, ce qui permettra d’ouvrir la voie de l’étude de la sulfo-click sur matrice d’ADN.

1. Clavé, G.; Dursun, E.; Vasseur, J. J.; Smietana, M., An Entry of the Chemoselective Sulfo-Click Reaction into the Sphere of Nucleic Acids. Org. Lett. 2020, 22, 1914-1918.
Highlited in Synfact, Trauner, D.; Shemet, A., Sulfo-Click Conjugation. Synfacts 2020, 16, 0600.
2. Clavé, G.; Vasseur, J. J.; Smietana, M., The Sulfo-Click Reaction and Dual Labeling of Nucleosides. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2020, 83, e120
3. Clavé, G.; Reverte, M.; Vasseur, J.-J.; Smietana, M., Modified internucleoside linkages for nuclease-resistant oligonucleotides. RSC Chem. Biol. 2021, 2, 94-150.

Les réactions chimiques basées sur des matrices d’ADN reposent sur les propriétés d'appariement spécifiques de brins d'acides nucléiques complémentaires. Ces derniers sont exploités afin de forcer la proximité spatiale entre des groupes réactifs d’ADN modifiés, dans le but d’accélérer une réaction à de très faibles concentrations. De nombreuses réactions chimiques ont été étudiées dans ce contexte, mais malgré leur sélectivité et leur efficacité supérieures, l'utilisation de réactions clic bioorthogonales et biocompatibles reste étonnamment faible. Nous pensons que l’étude de la ligation Thioacide/Azide (TAL) pourrait améliorer les performances des réactions sur matrice d’ADN et constituer un nouvel outil pour la bioconjugaison à l’ADN. Afin d'exploiter ce nouveau procédé, nous prévoyons de mettre au point des synthons nucléosidiques originaux fonctionnalisés avec les motifs thioacide et sulfonylazide. Dans un premier temps la TAL sera optimisée dans des conditions de synthèse classiques dans des tampons aqueux sur différents nucléosides en série ADN et ARN. Une fois cet objectif atteint, nous comptons démontrer l’intérêt de la TAL appliquée aux acides nucléiques en tant que nouvelle réaction de chimie clic appliquée à ces derniers. Par ailleurs, une série d’analogues de dinucléotide cycliques (CDN), cruciaux pour le système immunitaire sera également envisagé avec l'adénosine et la guanosine. En effet les CDN ont montré ces dernières années un potentiel important en raison de leur activité biologique, notamment dans le contexte des nouvelles méthodes de traitement du cancer. L’objectif principal du projet TALAN est de mettre au point une nouvelle réaction de ligation sur matrice d’acides nucléiques. D’importants efforts seront fournis afin d’incorporer les synthons adéquats sur des oligonucléotides (ODN) en série ADN et ARN. Ensuite, la TAL sur matrice d’ODN sera optimisée en s’intéressant notamment à une version utilisant des azides alkyls non électrodeficients. En effet, un nouveau chemin réactionnel avec une barrière d'énergie d'activation plus basse (réduction des facteurs entropiques) sera établi en raison de la forte molarité effective obtenue avec une matrice d'ADN. Cela nous permettrait de décrire pour la première fois une version de la TAL réalisée à température ambiante, dans un milieu biocompatible, à l’aide un azide non-électrodeficient. L’objectif final du projet TALAN est de parvenir à mettre en place cette réaction de ligation sur une matrice d’ARN d’intérêt biologique et de l’appliquer à des microARN (miARN) afin de développer une nouvelle méthode efficace permettant leur détection et leur quantification au sein de matrices biologiques complexes. En effet les miARN sont de petites molécules endogènes (19 à 24-mers) qui régulent négativement l'expression des gènes. Les diagnostics basés sur l'ARN peuvent jouer un rôle clé dans la gestion et la surveillance de nombreuses maladies en raison de variations importantes de leur concentration dans des échantillons biologiques solides (tissus, cellules) ou liquides (salive, sang, urine,…). L’optimisation de la structure chimique des ODN impliqués demandera de nombreux efforts afin d’améliorer le turnover de cette réaction catalysée et in fine d’augmenter la sensibilité de cette méthode.