Evolution de la chémoréception et transition(s) terrestre-aquatique chez les coléoptères Adephaga – Evo-AquaSense

Objectif 1 : Développer le dytique Rhantus suturalis comme modèle d'insecte aquatique pour l'étude fonctionnelle de la chémoréception. Etablissement d’un panel de molécules candidates (ligands potentiels des ORs de R. suturalis) d’après la pertinence biologique, la structure chimique et la disponibilité commerciale ; recherche de nouvelles molécules candidates dans des extraits de larves de moustiques par chromatographie en phase gazeuse et HPLC couplées à la spectrométrie de masse ; analyse fonctionnelle des ORs de R. suturalis dans des ovocytes de xénope avec la méthode de voltage clamp à deux électrodes en testant le panel de molécules candidates ; électro-antennogrammes sur antennes isolées exposées à des odorants, pour établir les courbes dose-réponse ; tests comportementaux ; séquençage et analyse de transcriptomes d’organes chimiosensoriels larvaires pour comparaison avec les répertoires exprimés chez l’adulte ; exploration neuro-anatomique détaillée par MEB et MET et immunofluorescence ; études d’expression par hybridation in situ pour les co-récepteurs des ORs et des IRs. Objectif 2 : Décrire la diversité des gènes et organes chimiosensoriels à travers les familles d'Adephaga terrestres et aquatiques Echantillonnage sur le terrain et micro-dissection des organes chimiosensoriels (insectes adultes) pour deux espèces phylogénétiquement éloignées au sein de chacune des familles actuelles d’Adephaga, incluant des taxons clés à collecter hors France métropolitaine ; production de données RNAseq pour les antennes et les palpes de ces espèces ; assemblages de transcriptomes et annotation des membres des familles connues de gènes chimiosensoriels, incluant les récepteurs (ORs, IRs, GRs), protéines de liaison des odorants (OBPs) et enzymes de dégradation des odorants; cartographie des lectures et estimation des niveaux d’expression des gènes ; pour la morphologie comparative : exploration par MEB et formalisation de caractères ; études d’expression chez des espèces choisies des co-récepteurs des ORs et des IRs par hybridation in situ. Objectif 3 : Comprendre l'évolution des gènes et des organes chimiosensoriels chez les Adephaga en lien avec les transitions écologiques. Etablissement de clusters d’orthologues conservés à l’échelle des coléoptères, construction d’une matrice multigènes pour analyses phylogénétiques des Adephaga en utilisant l’inférence Bayésienne avec des modèles site-hétérogènes ; étude de fossiles clés en utilisant le MEB environnemental et la nano-tomographie au synchrotron SOLEIL + reconstruction 3D ; codage de caractères, reconstruction d’états ancestraux des caractères sous un modèle d’évolution probabiliste (modèle Mk) ; tests de corrélation par ANOVA phylogénétique ; réconciliation d’arbre de gène et d’arbre de taxons pour inférer les duplications et pertes de gènes ; estimation des ratios dN/dS pour identifier les sites/acides aminés soumis à sélection positive.

Nous avons caractérisé les molécules émises dans l’eau par un coléoptère aquatique (le dytique Rhantus suturalis) ainsi que par l’une de ses proies favorites, la larve de moustique. Ces molécules, ainsi qu’une sélection d’autres composés volatiles, ont été testées pour leur capacité à stimuler le nerf antennaire du dytique, par électro-antennographie. La plupart des composés ont suscité une réponse, pour certains de forte amplitude. A l’échelle moléculaire, 15 récepteurs aux odeurs du dytique ont fait l’objet d’efforts pour identifier les molécules qui les activent ; en raisons de difficultés techniques, un seul de récepteurs a pu être caractérisé fonctionnellement à ce stade. Enfin, des protocoles de tests comportementaux ont été mis au point. Sur l’ensemble de ce volet du projet, une découverte majeure est que les molécules hydrophobes (non solubles dans l’eau) semblent jouer un rôle majeur dans l’écologie chimique de ces insectes aquatiques prédateurs.

Chez une autre espèce de dytique, nous avons comparé l’expression des récepteurs aux odeurs entre le stade larvaire et le stade adulte. Les analyses ont montré notamment que 5 récepteurs de la famille des ORs sont spécifiques du stade larvaire, mais que pour chacun il existe un récepteur très similaire spécifique du stade adulte. En revanche, pour l’autre grande famille de récepteurs aux odeurs (IRs), 14 gènes sont spécifiques de la larve et ils sont tous étroitement apparentés entre eux. Ces caractéristiques sont complètement différentes de ce qui a été observé jusqu’à présent chez des insectes à développement complet (avec larve et adulte) en milieu terrestre.

L’étude de l’évolution des gènes chimiosensoriels à l’échelle du grand groupe des coléoptères Adephaga s’est appuyée sur des séquençages massifs des gènes exprimés dans les antennes et les palpes chez 24 espèces distribuées dans 6 familles (certaines terrestres et certaines aquatiques). Les analyses ont montré que certaines lignées de gènes codant pour les récepteurs aux odeurs ont évolué très lentement alors que d’autres ont connu chez les familles aquatiques des épisodes massifs de duplications et de modification des séquences, probablement en lien avec l’adaptation à la détection des odeurs sous l’eau. De plus, alors que chez les coléoptères terrestres les récepteurs de la famille OR sont tous associés aux antennes, dans trois des familles aquatiques (dont les Dytiscidae), une lignée particulière de récepteurs, qui a connu beaucoup de duplications, s’exprime uniquement dans les palpes maxillaires. Chez R. suturalis, nous avons montré de plus que ces récepteurs s’expriment dans des structures sensorielles particulières, absentes chez les familles terrestres. Plus généralement, l’évolution de la structure des sensilles a été abordée par des analyses très poussées au microscope életronique à balayage chez plus d’une vingtaine d’espèces d’Adephaga représentant les différentes familles terrestres et aquatiques.

Evo-AquaSense était un projet exploratoire mettant en œuvre une grande palette d’approches et de techniques sur une grande diversité de coléoptères aquatiques. Le projet a généré une masse considérable de données expérimentales et comparatives, la plupart demeurant à ce stade descriptives. Ainsi, les perspectives ouvertes à court et à plus long terme sont considérables.

Pour aller plus loin sur le plan des études fonctionnelles, les difficultés rencontrées pour exprimer les OR de dytique dans des œufs de xénope suggèrent qu’il faudra passer à un autre système expérimental (expression dans des neurones sensoriels de drosophile, par exemple). Continuer ces études fonctionnelle permettra d’approfondir le lien entre les sites d’expression des ORs, l’évolution de leurs séquences, et la nature des odeurs qu’ils détectent. Il sera aussi particulièrement intéressant d’étudier fonctionnellement les récepteurs olfactifs spécifiques du stade larvaire. En effet, ce stade est strictement aquatique (alors que les adultes peuvent sortir de l’eau pour voler d’une mare à l’autre), et les ORs larvaires sont des variants spécialisés d’ORs exprimés chez l’adultes, ce qui pose la question de la signification fonctionnelle de cette spécialisation.

L’un des débouchés majeurs du projet étant l’importance des molécules hydrophobes dans la communication chimique en milieu aquatique, il serait intéressant de caractériser plus en détail la présence dans les habitats d’eau douce de signaux relevant de différentes classes de molécules et susceptibles d’être spécifiques de ces environnements. De même, approfondir les recherches sur le comportement des coléoptères en réponse à des signaux chimiques (notamment pour la reconnaissance des proies et des partenaires sexuels) représente une perspective stimulante pour l’avenir. L’étude des sites d’expression des récepteurs olfactifs et d’autres gènes chimiosensoriels par hybridation in situ chez le dytique Rhantus suturalis pourra également être poursuivie.

Dans le contexte du projet, l’étude de l’évolution des acteurs moléculaires de la chimioréception à l’échelle du groupe des coléoptères Adephaga concernait la famille des récepteurs ORs. Une suite logique serait donc d’étudier l’évolution d’autres familles-clés de gènes chimiosensoriels, comme les autres familles de récepteurs (GRs, IRs), les protéines de liaison aux odeurs (OBPs), les enzymes qui dégradent les odeurs …

L’étude de l’évolution de la morphologie et de la distribution des sensilles chez les coléoptères Adaphaga, en lien avec les transitions de milieu de vie, est un autre terrain fertile pour des recherches se situant dans la continuité du projet Evo-AquaSense. Les perspectives incluent la caractérisation des sensilles chez les familles qui n’ont pas pu être étudiées jusqu’à présent (Trachypachidae, Meruidae, Amphizoidae), mais également des études comparative à plus petite échelle taxonomique, particulièrement au sein de la grande famille des Dytiscidae.

Publications dans des journaux scientifiques internationaux

Montagné N., Jager M., Chertemps T., Persyn E., Jaszczyszyn Y., Meslin C., Jacquin-Joly E. & Manuel M. (2021) The chemosensory transcriptome of a diving beetle. Frontiers in Ecology and Evolution (en révision).

Jager M., Errais W., Trichet M. and Manuel M. (2021) Morphology of antennal and palpal sensilla of Hygrobia hermanni adults and larvae. Insects (soumis).

Communications orales

Michaël Manuel. Evolution of chemoreception and water-to-land transition in insects: focus on diving beetles (Dytiscidae). 10th edition of the EFOR Meeting, 11.05.2021.

Les sens chimiques (goût et odorat) jouent un rôle clé dans l'adaptation des espèces à de nouvelles niches écologiques, en particulier chez les insectes. Comprendre comment l'équipement chimio-sensoriel fondamentalement terrestre des insectes a été remodelé chez les lignées qui sont passées du milieu terrestre au milieu aquatique est d'un intérêt majeur, mais cette question demeure largement inexplorée. Notre projet vise à déterminer comment et quand les gènes et organes chimiosensoriels se sont adaptés à la vie aquatique chez les coléoptères Adephaga. Ces derniers représentent un modèle idéal pour aborder cet enjeu, car ils comportent des taxons terrestres, d'autres semi-aquatiques, et d'autres enfin qui sont spécialisés de manière très poussée à la vie aquatique – ces derniers étant des prédateurs importants de larves de moustiques dans les écosystèmes d'eau douce.
Le projet combine des approches fonctionnelles chez le dytique Rhantus suturalis (famille des Dytiscidae), et une étude comparative ambitieuse des gènes et structures chimiosensorielles dans un contexte phylogénétique, à l'échelle des Adephaga.
Dans la Tâche 1, nous nous proposons d'identifier les molécules odorantes reconnues par la trentaine d' "odorant receptors" (ORs) que nos analyses préliminaires en RNAseq ont permis d'identifier chez R. suturalis, y compris parmi de potentielles phéromones sexuelles, et parmi les molécules qui seront séparées par chromatographie à partir d'extraits de larves de moustiques. Cette approche sera complétée par des expériences fonctionnelles in vivo (électro-antennographie et tests comportementaux sur des R. suturalis adultes), par la comparaison des répertoires de gènes chimiosensoriels exprimés chez la larve (strictement aquatique) et l'adulte (amphibie), et par une description détaillée de la neuro-anatomie chimiosensorielle de R. suturalis.
Dans la tâche 2, les répertoires de gènes chimiosensoriels exprimés dans les antennes et les palpes de représentants des 11 familles actuelles des Adephaga seront comparés. De plus, nous réaliserons des études comparatives poussées des structures chimiosensorielles (types et distribution des sensilles) chez ces familles. Enfin, des hybridations in situ ciblant les co-récepteurs des ORs (associés à la détection des molécules hydrophobes chez les insectes aériens) et des récepteurs ionotropes (= IRs, détectant les molécules hydrophiles chez les insectes aériens) seront réalisées chez des représentants des principales familles.
Dans la tâche 3, nous viserons tout d'abord la résolution des relations phylogénétiques entre les familles d'Adephaga (encore aujourd'hui incertaines), par une approche phylogénomique. En parallèle, nous ré-examinerons la morphologie de fossiles se rattachant à des familles éteintes d'Adephaga (Mésozoïque) afin de ré-évaluer leur position dans la phylogénie, et de calibrer l'arbre moléculaire. Dès lors, il sera possible, au moyen des techniques de reconstruction d'états ancestraux de caractères, d'inférer: l'histoire de la (ou des) transition(s) terrestre-aquatique, l'évolution des caractères structuraux du système chimiosensoriel, et les duplications/pertes au sein des familles de gènes chimiosensoriels. Dans le cas des ORs, les fonctions des orthologues chez R. suturalis (résultats de la tâche 1) permettront de formuler des hypothèses sur la signification biologique de ces duplications/pertes. Des signatures de pression sélective seront également recherchées dans les séquences des gènes.
L'ensemble des résultats attendus donnera une image sans précédent des changements évolutifs ayant affecté les structures et gènes chimiosensoriels, en lien avec la transition terrestre-aquatique, chez une lignée d'insectes, et permettra de distinguer dans ce contexte les contributions relatives des processus d'adaptation et d'exaptation.