Prévention et contrôle de géminivirus nouveaux et invasifs infectant les cultures légumineuses dans le bassin méditerranéen – GeMed

Les méthodes et approches sont présentées selon les trois objectifs principaux du projet
A. Sur le volet écologie, des techniques standardisées seront utilisées pour évaluer la prévalence des géminivirus dans le Bassin Méditerranéen (BM) et selon les espèces hôtes: collecte d’échantillons de plantes et d’insecte, conservation, extraction d’ADN et tests de détection viral par PCR et séquençage profond. Les virus ciblés dans ce projet sont transmis par l’aleurode Bemisia tabaci à l’exception du Chickpea chlorotic dwarf virus (CpCDV) transmis par cicadelle. Alors que le CpCDV a été détecté dans le BM, la cicadelle vectrice n’y a pas été identifié. La cicadelle vectrice sera recherchée par des tests de transmission, des observations morphologiques sur organe disséqué, et des analyses moléculaires.
B. Pour progresser dans la compréhension des émergences de géminivirus invasifs, nous utilisons comme modèle IS76, un recombinant du Tomato yellow leaf curl virus qui a envahi le Maroc et a gagné l’Espagne. IS76 a émergé sous l’effet d’une sélection positive exercée par des variétés de tomate résistantes. Les bases génétiques et moléculaires de cette sélection seront étudiées à l’aide de recombinants artificielles, par transcriptomique et par séquençage à haut débit de petits ARNs. IS141 est un recombinant italien similaire à IS76. Son analyse en conditions contrôlées montre qu’il est sélectionné positivement par les variétés résistantes. Des échantillonnages de terrain permettront de tester son pouvoir invasif.
C. Des techniques standards de protection intégrée seront testées telles que le paillage, les cultures associées, le piégeage de vecteurs. Parallèlement, des métabolites issus de plante seront évalués pour leur efficacité contre les insectes vecteurs et des nouvelles sources de résistance des plantes seront recherchées. La combinaison de différentes techniques sera également testée. Des essais de vaccination ARN de plantes contre des géminivirus seront entrepris.

A- Ecologie des geminivirus
Des protocoles communs ont été adoptés pour l’échantillonnage et le traitement de plantes et insectes vecteurs. Leur mise au point a été possible suite à (i) la détermination du nombre de plantes pouvant être testées en groupe, (ii) la préparation et l’envoi entre partenaire des contrôles positifs pour le diagnostic viral et (iii) la conduite d’un test multi-site pour standardiser les protocoles. Les échantillons de feuille sont séchés sur CaCl2 et les insectes conservés dans l’éthanol.
Pour trouver la cicadelle vectrice du chickpea chlorotic dwarf virus (CpCDV), des critères morphologiques complexes utilisés par les taxonomistes ont été nécessaires pour distinguer les espèces de cicadelle. La microscopie de cicadelles récoltées en Tunisie a permis de repérer une cicadelle potentiellement vectrice du CpCDV. Des tests de transmission sont en cours pour confirmer l’identification du vecteur.
B- Compréhension des phénomènes d’émergence de geminivirus
Une analyse ARNomique a été initiée pour identifier des interactions virus-plante associées à un contournement de résistance impliquant des tomates résistantes Ty-1 et des recombinants invasifs du Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Des librairies de petits ARNs et de transcrits ont été préparées et séquencées à haut débit par la technique Illumina. L’analyse des séquences est en cours.
C- Contrôle des géminivirus
Des huiles de Citrus aurantium ont été extraites et testées contre le vecteur Bemisia tabaci. Des essais préliminaires montrent un effet toxique sur l’aleurode mais la concentration à 10% est phytotoxique.
Plusieurs accessions de Cucurbita moschata ont été considérées comme donneur de résistance à la courgette contre le Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV).
Une stratégie de vaccination ARN a été testé contre le ToLCNDV. Une construction dsARN unique ciblant trois régions de son composant A a été préparée, et des tests préliminaires sont en cours en conditions contrôlées.

Le projet a pour objectif de fournir aux acteurs, une carte de distribution des géminivirus et ADNs satellites infectant les cultures légumières en Méditerranée. Avec les mêmes protocoles d’échantillonnage et de tests de détection utilisés par les partenaires, il sera possible de comparer les prévalences entre pays. Outre le suivi des géminivirus précédemment décrits, le projet vise aussi à repérer des géminivirus encore non décrits en Méditerranée et potentiellement émergents. Pour ce faire, des insectes phloemophages récoltés dans, et autour des cultures sont utilisés comme des échantillonneurs de virus présents dans l’environnement. Après amplification des génomes de geminivirus potentiellement présents, ils sont séquencés à haut débit.

La maladie du chickpea chlorotic dwarf devrait être contrôlée de façon plus efficace à la fin du projet quand sa cicadelle vectrice et son écologie seront connues.

Une reconstruction du scenario d’émergence d’un géminivirus invasif au Maroc sera disponible. Il permettra de sensibiliser les acteurs au risque d’émergence de nouveaux variants qui peuvent potentiellement compromettre les méthodes habituelles de contrôle.

Le projet devrait produire des résultats pouvant améliorer le contrôle des geminivirus. Il s’agit notamment de l’amélioration potentielle des méthodes habituelles, avec des huiles essentielles, des associations de culture, du paillage, et du piégeage de vecteurs. Les essais d’application de dsARN et siARN sur plante génèreront des résultats sur l’efficacité et la faisabilité de la vaccination ARN contre des geminivirus. Le criblage d’accessions du genre Cucurbita pour la résistance au ToLCNDV devraient permettre d’identifier de nouvelles sources de résistance. Enfin, les interactions inter-génomiques détectées entre tomate et recombinants invasifs de TYLCV par une approche RNAome révèleront potentiellement des gènes exploitables pour la sélection de nouveau cultivars de tomate résistant au TYLCV.

Pas de production scientifique pour le moment

Tomate et cucurbitacées sont des cultures maraichères de premier plan en région méditerranéenne. Leur culture continue sur toute l’année, avec un nombre réduit de variétés, les rendent vulnérables à des agents pathogènes émergents et invasifs tels que les virus.

Les géminivirus sont particulièrement préoccupants en raison des pertes économiques qu’ils engendrent, des introductions fréquentes de nouvelles espèces dans la région et, de l’émergence de souches recombinantes potentiellement invasives et pouvant contourner des gènes de résistance.

GeMed a pour objectif d’améliorer la prévention et le contrôle de ces attaques virales grâce à une coopération entre virologistes, entomologistes, généticiens, sélectionneurs, et bioinformaticiens. Les objectifs scientifiques de GeMed répondent à des défis majeurs du thème 1.2.2 de PRIMA à savoir,
(i) approfondir les connaissances sur l’écologie des géminivirus potentiellement invasifs en impliquant des partenaires présents aux quatre coins de la Méditerranée ;
(ii) comprendre les phénomènes d’émergence de géminivirus recombinants invasifs par des observations au champ et l’analyse d’interactions plante–virus utilisant des clones infectieux et faisant appel à du séquençage profond de transcriptome et de siARN ;
(iii) développer de nouvelles méthodes de gestion intégrées avec des métabolites de plantes ciblant les insectes vecteurs, et des vaccins induisant des siARN ciblant des virus.

Le potentiel d’innovation de GeMed réside dans l’exploration des mécanismes moléculaires qui sous-tendent une émergence virale, la recherche de nouveaux gènes de résistance et la validation de la vaccination par siARN.

Deux sociétés semencières participant à GeMed sont les premières parties prenantes. L’exploitation et la dissémination des résultats se feront également par des organisations professionnelles manifestant leur intérêt pour GeMed et plus largement via des organisations internationales (EPPO, ProMED).