Mécanismes de réparation et toxicité des glycoles de thymine, une des principales lésions oxydatives de l'ADN – TG-TOX

Des lignées humaines knock-out pour les protéines NTH1 et NEIL1 ou doubles knock-out NTH1/NEIL1 ont été générées par la technologie de CRISPR-Cas9.
La cinétique de réparation des TG a été étudié après l’exposition des cellules à différents agents oxydants tels que des produits chimiques ou des rayonnements ionisants. Les mesures de TG ont été réalisés en utilisant le test des comètes, l’immmunodétéction des TG avec des anticorps spécifiques ou le HPLC-MS/MS.
Le laboratoire Français a utilisé la technique de micro-irradiation laser afin d’introduire des lésions dans des régions présélectionnées du noyau des cellules vivantes dans le but de suivre le recrutement des différents composants des voies de réparation de l’ADN et de mesurera la cinétique de réparation des dommages in situ.
Le laboratoire allemand, grâce à l’introduction de TG synthétiques au sein de gènes rapporteurs fonctionnels, a analysé les mécanismes de réparation ainsi que les conséquences de la présence de TG pour la mutagenèse induite lors de la transcription et la réplication de l’ADN.

Des lignées cellulaires humaines déficientes en une ou plusieurs protéines de réparation ont été générées par la technique de CRISPR/Cas9 par le laboratoire Allemand. Grace à l’utilisation de ces lignées et par des approches complémentaires menées en parallèle au sein des deux laboratoires français et allemand nous avons déterminé que l’ADN glycosylase NTH1 joue un rôle prépondérant dans la réparation des TG dans notre modèle cellulaire.

Afin de déterminer les cinétiques de réparation des TG au sein du génome nucléaire, les niveaux de TG ont été mesurés plusieurs temps après l’exposition des cellules à des stress oxydatifs induits par des molécules chimiques ou par des rayonnements ionisants. Les tests de comète et l’immunodétection de TG (possible grâce à l’utilisation d’un anticorps spécifique) ont été utilisés dans un premier temps mais ne nous ont pas permis de conclure, probablement à cause d’un manque de sensibilité lié à ces techniques. Une collaboration a donc été établie avec le Dr. Michael Musheev (IMB, Mainz), spécialiste de la détection de dommages de l’ADN par la technique hautement sensible et spécifique de HPLC-MS/MS. Des mesures des niveaux de TG dans les différents modèles cellulaires sont en cours.

Nous nous sommes intéressés ensuite à la relocalisation subcellulaire des glycosylases NTH1 et NEIL1 induites par l’exposition des cellules au stress oxydatif. Nous avons observé que l’exposition des cellules au KBrO3 induit le recrutement à la chromatine des deux protéines de façon dépendante des complexes cohésines et Médiateur. Ces résultats, publiées dans la revue Nucleic Acids Research en 2020, ouvrent des nouvelles perspectives et représentent une avancée majeure dans le domaine.

Enfin, l’utilisation de la technique de microirradiation laser, optimisé ici pour induire des TG de façon localisé au sein du noyau, a été utilisé pour suivre le recrutement de NTH1 et NEIL1 en temps réel dans des cellules vivantes.

Les perspectives pour la période restante seront de continuer les mesures de cinétique de réparation des TG dans les différents contextes cellulaires. Pour ceci nos collaborateurs à l’IMB utiliseront la technique de HPLC-MS/MS. En parallèle, nous utiliserons la technique de micro-irradiation laser nous permettant d’induire des niveaux de TG détectables par immunofluorescence. Des développements supplémentaires seront nécessaires afin de permettre de microirradier un grand nombre de cellules afin de pouvoir faire des mesures statistiques fiables.

Afin de déterminer si le recrutement des ADN glycosylases NTH1 et NEIL1 au site de microirradiation laser est en effet conséquence de leur activité sur les dommages oxydatifs de l’ADN, des mutations ponctuelles ont été introduites sur les sites catalytiques des enzymes. Les dynamiques de recrutement et de solubilisation des protéines sauvages et mutantes à la zone microirradié sera analysé en temps réel.

Malgré le rôle prépondérant de NTH1 dans la réparation du TG, nous ne pouvons pas exclure la participation de NEIL1 ou de la voie NER dans des contextes particuliers. Pour cela, l’équipe allemande va éteindre leurs études à d’autres lésions générées par la même voie que le TG, telles que le OH-dU ou le HydT. Pour cela des lésions synthétiques seront introduites dans des plasmides portant des gènes rapporteurs afin de mesurer leur impact sur la transcription.

Le laboratoire allemand a récemment développé une méthode très sensible, permettant de mesurer la mutagenèse induite par la présence de lésions au niveau de l’ADN. Le séquençage à haut débit des plasmides portant un TG synthétique a montré que cette lésion n’induisait pas de mutagenèse significative pendant la réplication ou la transcription. Ceci suggère que d’autres lésions pourraient être potentiellement impliquées dans la mutagenèse et le blocage de fourche qui ont été observés après l’induction des dommages des thymines.

Publications
- Lebraud, E., Pinna, G., Siberchicot, C., Depagne, J., Busso, D., Fantini, D., Irbah, L., Robeska, E., Kratassiouk, G., Ravanat, JL, Epe, B., Radicella, JP, Campalans, A. Chromatin recruitment of OGG1 requires cohesin and mediator and is essential for efficient 8-oxoG removal. Nucleic Acids Res. (2020) doi:10.1093/nar/gkaa611.

Communications dans des congrès nationaux ou internationaux
- Lebraud, E., d’Augustin, O., Dépagne, J., Pinna, G., Radicella, J.P., Campalans, A. New role of chromatin organizers in the recognition and repair of oxidative DNA damage. IMB Conference “Chromosome Territories & Nuclear Architecture” 2019, Mainz. EMBO price for the best poster presentation
- Robeska, E., Lebraud, E. Rodriguez, M., Müller, N., Farag, A., Radicella, J.P., Khobta, A., Campalans, A. Subnuclear Dynamics of Thymine glycol DNA Glycosylases NTH1 and NEIL1 in response to oxidative DNA damage. IMB Conference. “Chromosome Territories & Nuclear Architecture”, 2019, Mainz. (Poster presentation)

- Sarmini, L. and Khobta, A. Nucleotide excision repair of oxidatively induced DNA damage. GUM young scientist workshop, 2021. Award for the best talk

Les glycols de thymine (TG) sont des lésions oxydatives de l’ADN, notamment produites par l’oxydation des bases thymine et 5-methylcytosine. Les TG sont induites par les rayonnements ionisants mais aussi dans une moindre mesure par l’exposition à des espèces radicalaires de l’oxygène d’origine endogène. Les TG forment une structure non-plane et sont incapables de former des liaisons Watson-Crick ce qui provoque une distorsion de la double hélice d’ADN et représente potentiellement une entrave à la réplication de l’ADN. Ces propriétés font des TG une lésion particulièrement cytotoxique en comparaison à d’autres bases oxydées. Des études biochimiques ont montré qu’au moins deux ADN-glycosylases peuvent initier la réparation des TG par la voie de Réparation par Excision de Bases. Néanmoins, prenant en considération des données structurales, d’autres mécanismes de réparation pourraient aussi jouer un rôle dans l’élimination des TG. La participation des différentes voies de réparation de l’ADN dans l’élimination des TG dans le contexte cellulaire reste à explorer.
Le présent projet représente un effort collaboratif dédié à l’élucidation de la relevance biologique des différentes voies de réparation de l’ADN pouvant prendre en charge les TG ainsi que l’identification de facteurs qui pourraient déterminer le choix du mécanisme de réparation dans les cellules humaines. Des modèles cellulaires humains seront générés dans lesquels les principaux composants de la voie de réparation par excision de bases (les ADN glycosyases NTH1 et NEIL1) et d’autres mécanismes de réparation potentiellement impliqués seront inactivés. Le laboratoire français utilisera entre autres la technique de micro-irradiation laser afin d’introduire des lésions dans des régions présélectionnées du noyau des cellules vivantes dans le but de suivre le recrutement des différents composants des voies de réparation de l’ADN et de mesurera la cinétique de réparation des dommages in situ. Le laboratoire allemand, grâce à l’introduction de TG synthétiques au sein de gènes rapporteurs fonctionnels, analysera les mécanismes de réparation ainsi que les conséquences de la présence de TG pour la transcription et la réplication de l’ADN. Grace à l’utilisation d’une grande diversité d’approches complémentaires nous espérons pouvoir révéler l’implication des différents mécanismes de réparation de l’ADN dans la reconnaissance et l’élimination des TG dans les cellules vivantes.