Briser le code de myélinisation – BRECOMY

Les cellules de Drosophiles sont du génotype nrv2Gal4UAScherry/APEX2. Dans cette lignée transgénique, les deux gènes rapporteurs mCherry et APEX2 sont exprimés par les cellules gliales engainantes (nrv2+). Le cerveau de drosophile au stade larvaire III est disséqué et les cellules cérébrales sont dissociées. En fonction du stade developemental du recipiendaire, 5 à 16 000 cellules sont transplantées (soit environ 500 à 1600 cellules gliales) dans le ventricule cérébral de têtards. Les têtards proviennent de la lignée transgénique MBP-GFP-NTR dans la quelle grâce au transgène NTR nous pouvons induire une ablation des oligodendrocyte s myélinisant et donc une demyélinisation conditionnelle par introduction dans l’eau de nage de metronidazole (Kaya et al., J. Neurosci. 2012 ; Mannioui et al., Mult. Sclerosis 2018 ; Mannioui & Zalc, Methods Mol Biol. 2019). Grâce à la transparence des têtards de Xenope l’expression de mCherry, détectée au macroscope (AZ100 Nikon) permet de suivre, in vivo, les cellules gliales de Drosophile dans le cerveau de Xénope. Après fixation et traitement par la DAB, ces cellules et leur enroulement éventuel autour des axones sont visualisés en microscopie électronique, après inclusion dans l’Epon et coupes ultrafines (70nm, ultra microtome UC7 Leica Microsystem). Les coupes sont montées sur des grilles de cuivre de 200mesh (Electron microscopy science cat# EMS200-Cu) puis contre-colorées par une solution de citrate de plomb avant d’être examinées sur le HT7700 electron microscope (Hitachi) à 70kV. Les photos sont prises sur la camera intégrée AMT XR41-B camera (2048X2048 pixels).

Le but de ces expériences est d’établir si des cellules gliales de Drosophile transplantées dans le cerveau de Xénope peuvent i) survivre et ii) myéliniser des axones de Xénope. Dans la lignée transgénique nrv2Gal4UAScherry/APEX2 les cellules gliales engainantes de Drosophile expriment deux gènes rapporteurs, mCherry et APEX2. Le rapporteur mCherry permet de repérer les cellules de Drosophile en microscopie à fluorescence. La présence de corps cellulaires mCherry nous permet de suivre la survie et la migration des cellules de Drosophile dans l’environnement cérébral du Xénope. Nous nous focalisons plus particulièrement sur des structures rectilignes allongées, suggestives d’un enroulement de type myélinique. Le rapporteur APEX2 après réaction avec la DAB permet une reconnaissance de ces mêmes structures de Drosophile en microscopie électronique. Nos premières observations montrent des images d’enroulements relativement compacts (jusqu’à 6 à 7 tours de spires) autour d’axones de Xénope. Le traitement par le metronidazole des têtards greffés permet d’éliminer les oligodendrocytes (et les gaines de myeline) de Xénope. La présence de précipité de DAB sur les enroulements nous assure de l’origine Drosophile de ces enroulements. Ces résultats encore préliminaires, sont encourageants, montrant que les cellules gliales de drosophile peuvent non seulement survivre et migrer dans un environnement de Xénope, mais qu’elles peuvent aussi former des « pseudo-gaines » de myéline autour d’axones de Xénope. Ceci suggère que la potentialité de myélinisation est portée par les axones.

Ces résultats sont préliminaires et doivent à ce stade rester confidentiels. Ils doivent être confirmés et nous porterons une attention particulière à étudier la migration et la survie des cellules de Drosophile transplantées dans le cerveau de Xénope. Nous étudierons également l’importance et les conséquences de varier les sites de transplantation. Afin de tester des facteurs permettant d’augmenter ou de diminuer la capacité des cellules engainantes de Drosophile à former des gaines de pseudo-myéline autour des axones de Xénope, nous développons parallèlement des systèmes de co-culture de cellules de Xénope et de Drosophile. D’une part nous mettons au point des conditions de culture myélinisante de Xénope, ainsi que les possibilités de démyéliniser ces cultures et d’autre part nous recherchons des milieux de culture favorables aux deux espèces. Ces travaux sont en cours.

Rey S, Zalc B, Klämbt C. Evolution of glial wrapping: a new hypothesis [published online ahead of print, 2020 Mar 4]. Dev Neurobiol. 2020;10.1002/dneu.22739. doi:10.1002/dneu.22739
Lubetzki C, Zalc B, Williams A, Stadelmann C, Stankoff B. Remyelination in multiple sclerosis: from basic science to clinical translation. Lancet Neurol. (2020) in press.
Martin E, Aigrot MS, Grenningloh R, Stankoff B, Lubetzki C, Boschert U, Zalc B. Bruton’s tyrosine kinase inhibition promotes myelin repair. Brain Plasticity (2020) DOI 10.32.33/BPL-200100; in press.

Il est généralement admis que l’émergence des vertébrés a été rendue possible par l’acquisition de la crête neurale, qui a conduit au développement, avantageux d’un point de vue évolutif, du complexe structural de la tête. De ce point de vue, une des contributions cruciales d’un dérivé de la crête neurale est, concomitamment à celle d’une mâchoire articulée, l’acquisition de la gaine de myéline. En l’absence de cette structure, les vertébrés tels que nous les connaissons n’auraient pas pu exister.Malheureusement, la survenue d’une démyélinisation dans certaines affections neurologiques, dont la plus fréquente est la Sclérose en Plaques, est extrêmement délétère et conduit progressivement à un handicap permanent. Malgré la survenue dans la SEP d’une remyélinisation spontanée, un mécanisme crucial de réparation, beaucoup de lésions ne remyélinisent pas, malgré la présence abondante de précurseurs d’oligodendrocytes dans et autour des lésions de démyélinisation. Qu’est-ce qui empêche ces cellules de myéliniser ? Est-ce l’absence à la surface des axones de facteurs attractifs ou au contraire l’expression à la surface axonale de facteur inhibiteurs répulsifs ? Alternativement, est-ce le programme oligodendroglial de myélinisation qui est inhibé par quelques facteurs présents dans la lésion ? L’ambition de notre projet est d’attaquer ce problème sous un angle totalement nouveau. A l’exception des agnates, tous les vertébrés sont myélinisés. Au contraire chez les insectes les axones ont au plus 1 (rarement 2) tours de spire par les cellules gliales engainantes et ne sont pas myélinisés. Notre hypothèse de travail est que parvenir à briser le code permettant aux cellules gliales engainantes de myéliniser ouvrirait la porte à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques conduisant à la réparation des lésions de Sclérose en Plaques qui sinon ne remyélinisent pas. Notre projet de recherche propose d’identifier les conditions minimales suffisantes à l’induction d’un programme de myélinisation. L’originalité et l’innovation de notre projet de recherche repose sur le caractère unique de notre modèle expérimental consistant en l’association de cellules d’invertébrés et de vertébrés, une combinaison pour laquelle les deux partenaires coordinateurs (C. Klämbt et B. Zalc) possède les compétences et l’expertise nécessaires.