Décryptage du rôle de la sialidase membranaire NEU1 dans les macrophages – MACRONEU1

La tâche 1 du projet vise à identifier les partenaires d'interaction (ou interactome) de la sialidase membranaire NEU1 dans les macrophages. Pour cela, deux approches complémentaires sont proposées. La première est basée sur une purification en tandem couplée à une identification par spectrométrie de masse. La seconde repose sur la technologie du double hybride optimisée par la détection des interactions entre protéines membranaires (membrane yeast two-hybrid). Celle-ci sera réalisée à partir d'une banque d'expression issue de macrophages réalisée dans le laboratoire. Les candidats prometteurs seront validés par d'autres approches et la relevance de ces nouvelles interactions avec NEU1 dans le contexte de l'athérosclérose étudiées en détails.
La seconde tâche du projet vise à développer de nouveaux outils innovants pour bloquer spécifiquement l'activité catalytique de cette sialidase. Elle repose sur des travaux récents du porteur de projet ayant démontré que NEU1 dimérise à la membrane plasmique des cellules et que cette dimérisation joue un rôle important pour son activité catalytique (Maurice et al. Sci Rep. 2016). Des peptides synthétiques couvrant son interface de dimérisation membranaire (peptides interférents) seront couplés à une étiquette Tat ou directement solubilisés dans des micelles de détergent et leurs effets sur la dimérisation membranaire et l'activité sialidase de NEU1 évalués in vitro and in silico à l'aide d'approches de modélisation et de dynamique moléculaires. Une fois validés, ces outils seront transférés pour la tâche 3 du projet.
Cette tâche 3 vise à évaluer le potentiel thérapeutique de ces peptides interférents ciblant NEU1 dans différents modèles murins d'athérosclérose. Une étude de biodistribution sera préalablement réalisée afin de déterminer la voie d'administration optimale, la dose optimale à injecter ainsi que la fréquence d'injection.

Concernant la première tâche du projet, une des deux approches proposées a été développée et les résultats valorisés par une publication scientifique. A l’aide de cette approche, nous avons pu dresser une première liste de partenaires d’interaction potentiels de NEU1, dont le récepteur CD36. La caractérisation approfondie de cette interaction entre NEU1 et CD36 a notamment permis de mettre en évidence un rôle modulateur de NEU1 sur le niveau de sialylation de CD36 en réponse à une stimulation des macrophages par les peptides d’élastine qui s'accompagne également d'une potentialisation de l’incorporation des LDL oxydés d'environ 40% dans ces cellules. Ces nouvelles données démontrent donc pour la première fois que le complexe récepteur de l'élastine, au travers de sa sous unité NEU1, régule l'incorporation des LDL oxydés au niveau des macrophages et pourraient ainsi expliquer, en partie, les effets délétères de ces peptides d'élastine sur l’athérosclérose. La seconde approche est actuellement en cours de développement. Concernant la seconde tâche du projet, dédiée au développement de stratégies d’interférence par peptide pour bloquer la dimérisation membranaire de NEU1 et son activité catalytique, les travaux ont également bien avancé et montrent que les deux formulations proposées inhibent d'environ 40 à 50% la formation de dimères de NEU1, d'environ 40% l’activité sialidase membranaire de NEU1 dans un modèle cellulaire de sur-expression, et d'environ 30% dans les macrophages (expression endogène) en réponse à une stimulation par les peptides d'élastine. Concernant la tâche 3 du projet, dédiée à l’évaluation in vivo des effets de ces peptides interférents ciblant NEU1 dans l’athérosclérose, le démarrage de cette tâche était conditionné à la réalisation d’une étude de biodistribution de ces peptides. Celle-ci a été réalisée dernièrement et les résultats sont en cours d’analyse.

Le projet MACRONEU1 a pour ambition d'étendre nos connaissances scientifiques sur le rôle de cette sialidase au niveau moléculaire et cellulaire et de développer de nouveaux outils pharmacologiques ciblant son activité catalytique. Par l'identification de l'interactome membranaire de NEU1, ce projet devrait ouvrir de nouvelles pistes de recherche pour mieux comprendre le fonctionnement de cette sialidase à la membrane des cellules et en quoi ces nouvelles interactions pourraient influencer le bon fonctionnement des cellules dans une situation physiopathologique donnée. Par ailleurs, le développement d'outils innovants, ciblant spécifiquement l'activité sialidase de NEU1, et l'évaluation de leur potentiel thérapeutique dans un modèle murin d'athérosclérose devraient permettre de déterminer si l'inhibition de l'activité catalytique de NEU1 pourrait constituer une cible de choix pour diminuer le développement de l'athérosclérose.

A ce jour, deux articles scientifiques issus du projet MACRONEU1 ont été publiés :
1) Kawecki C, Bocquet O, Schmelzer CEH, Heinz A, Ihling C, Wahart A, Romier B, Bennasroune A, Blaise S, Terryn C, Linton KJ, Martiny L, Duca L, Maurice P. Identification of CD36 as a new interaction partner of membrane NEU1: potential implication in the pro-atherogenic effects of the elastin receptor complex. Cell Mol Life Sci. 2019; 76(4):791-807.
2) Bennasroune A, Romier-Crouzet B, Blaise S, Laffargue M, Efremov RG, Martiny L, Maurice P & Duca L. Elastic fibers and elastin receptor complex: Neuraminidase-1 takes the center stage. Matrix Biol. 2019; 84:57-67.

Par ailleurs, les résultats issus de ce projet ont été présentés lors de différentes manifestations scientifiques :
1) International congress «Membrane Biophysics of Exo-Endocytosis from Model Systems to Cells«, Mandelieu-la-Napoule, France (3-6 avril 2019). Communication orale intitulée «Characterization and evaluation of NEU-1 activity inhibition by interfering peptide approaches«.
2) 15e congrès annuel de la NSFA - Biarritz, France (19-21 juin 2019). Communication affichée intitulée «Développement d’une stratégie originale d’inhibition de la dimérisation et de l’activité sialidase associée de la neuraminidase-1 par utilisation d’un peptide interferent«.
3) 44th FEBS congress, Cracovie, Pologne (6-11 juillet 2019)? Communication affichée intitulée «Effects of interfering transmembrane peptides on Neuraminidase-1 activity: cellular and integrated approaches«.
4) Journée Rémoise des jeunes chercheurs en Santé, Reims, France (17 octobre 2019). Communication orale intitulée «Potentiel inhibiteur de peptides transmembranaires interférents sur l’activité de la neuraminidase-1«.

Les sialidases (neuraminidases) constituent une famille d'exoglycosidases qui clivent les résidus d'acide sialique terminaux des glycoprotéines, glycolipides et oligosacharides. Leur présence affecte les propriétés moléculaires et structurales de ces glycoconjugués, modifiant ainsi leur fonction et leur interaction avec d'autres molécules à l'intérieur de la cellule, entre cellules, et entre les cellules et la matrice extracellulaire. Chez l'homme, la famille des sialidases comportent 4 membres dont la sialidase lysosomale NEU1. Des données récentes de la littérature montrent qu'en plus du lysosome, NEU1 peut être présente à la membrane plasmique de nombreux types cellulaires où elle est impliquée dans la transduction des signaux et dans l'élastogénèse au travers du complexe récepteur de l'élastine, et dans la régulation et la transactivation de récepteurs par désialylation. Par conséquent, NEU1 émerge comme un acteur clef de la régulation cellulaire.
En dépit d'un intérêt grandissant de la communauté scientifique pour NEU1, notamment car NEU1 est la cible de l'oseltamivir phosphate, l'anti-grippal Tamiflu, peu de choses sont connus sur le rôle de NEU1 dans les macrophages, acteurs critiques de l'athérosclérose. Cette pathologie vasculaire est à la base de nombreuses maladies cardiovasculaires (MCV) constituant la première cause de mortalité dans le monde et un problème majeur de santé publique. L'incidence des MCV augmente avec le vieillissement croissant de la population et génère des coûts directs et indirects colossaux en France, dans l'Union Européenne et dans la plupart des pays développés. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l'athérosclérose est donc requise pour identifier de nouvelles molécules pharmacologiques innovantes, améliorer la qualité de vie de nos concitoyens et réduire les impacts financiers et sociétaux de ces pathologies vasculaires dévastatrices.
Ce projet de recherche de 3 ans (MACRONEU1) se propose de réunir un ensemble de participants de renommée internationale, afin d'étudier et de décrypter le rôle de la NEU1 membranaire dans les macrophages et dans l'athérosclérose selon deux versants originaux. Le premier réside dans l'identification et la caractérisation fonctionnelle de partenaires d'interaction membranaires de NEU1 dans les macrophages à partir de deux approches complémentaires : une approche par purification en tandem et une approche par criblage double hybride par split ubiquitine. Une première série de partenaires relevant a d'ores et déjà été identifiée et la caractérisation fonctionnelle de trois d'entre eux est proposée : CD36, TLR et la protéine Galphai2. Le second versant est basé sur des données récentes du coordinateur scientifique de ce projet ayant montré, pour la première fois, que NEU1 présente une interface de dimérisation transmembranaire impliquée dans la dimérisation et l'activité sialidase de NEU1 (Maurice et al, Sci Rep. 2016). Il propose de développer deux stratégies complémentaires d'interférence par peptide afin de bloquer la dimérisation de NEU1 et son activité sialidase. Ces peptides seront évalués in vitro and in vivo, en parallèle du Tamiflu, inhibiteur à spectre large, dans différents modèles murins d'athérosclérose, afin de déterminer si NEU1 pourrait constituer une cible pharmacologique pertinente dans l'athérosclérose.
Dans son ensemble, ce projet ambitieux et novateur apportera sans aucun doute des informations majeures sur NEU1 et son rôle dans les principales fonctions du macrophage en lien avec l'athérosclérose, et proposera une stratégie innovante à haute valeur ajoutée pour cibler NEU1 in vivo et évaluer son potentiel thérapeutique sur l'athérosclérose. De manière importante, la contribution de NEU1 dans l'athérosclérose et l'utilisation du Tamiflu dans cette pathologie vasculaire n'ont jamais été considérées jusqu'à présent.