Circuits génétiques et métaboliques pour le diagnostic médical – SynBioDiag

Le projet est composé de quatre principales tâches. Dans un premier temps (Tâche 1), des échantillons cliniques sont collectés au CHU de Montpellier. Ces échantillons collectés dans le sérum, l'urine et les tissus de patients du cancer de la prostate (PCa) et les biomarqueurs sont ensuite quantifiés par chromatographie liquide et spectrométrie de masse ciblée à haute résolution (LC-MS). Nous concevons ensuite des biocapteurs pour les biomarqueurs ayant des concentrations différentielles selon la littérature et l'analyse LC-MS sur des patients et des échantillons de contrôle. Des circuits hybrides analogiques/numériques sont alors construits dans E. coli (Tâche 2) pour détecter des signaux multiplexés (c'est-à-dire plusieurs biomarqueurs) par des voies métaboliques et pour amplifier les signaux à l'aide de commutateurs génétiques. Les circuits exprimés dans des extraits cellulaires d'E. coli sont lyophilisés et déposés sur du papier (Tâche 3). Finalement (Tâche 4), les biocapteurs bactériens sont réhydratés sur papier et testés sur les échantillons cliniques acquis dans la première tâche. Les résultats des biocapteurs (niveaux de fluorescence) sont comparés aux données LC-MS et aux cribles PSA (prostate cancer antigen). Les biocapteurs sont optimisés en modulant les voies métaboliques et les commutateurs génétiques.

Sélection de biomarqueurs et design de biosenseurs. Au moyen d’une étude bibliographique couplée à une analyse bioinformatique, nous avons établi une liste de 15 métabolites biomarqueurs du cancer de la prostate (PCa). Cette liste de biomarqueurs a été transmise au laboratoire d’analyse LC-MS afin de faire caractériser leur concentration dans les échantillons cliniques prélevés par le CHU de Montpelier. Des biocapteur (hubs) permettant la détection indirecte de plusieurs biomarqueurs via diverse transducteurs ont été particulièrement priorisés. En effet, ces hubs sont nécessaires à l’élaboration de circuits plus complexes (additionneurs, perceptron…).

Systèmes de détection analogue. Une série de biocapteurs sélectionés, a été construite et caractérisée dans un environnement acellulaire. En suivant une méthodologie développé lors d'une preuve de concept (construction de système complexes réalisé pour les dérivés de l’acide benzoïque), nous avons mis au point et optimisé un biocapteur acellulaire détectant le peroxyde d’hydrogène, effecteur central (hub) auquel nous avons pu brancher plusieurs transducteurs permettant la détection de diverses molécules biomarqueurs précédemment identifiés. Des biosenseurs détectant la Sarcosine et le Lactate ont ainsi été développés et optimisés.

Biocapteurs hybrides analogues/numériques. Nous avons placé des interrupteurs à recombinases sous le contrôle de facteurs de transcription “hubs” tel que H202 capables d'être intégré à des signaux des transducteurs métaboliques (lactate dehydrogenase, convertissant le lactate en H202.). L’utilisation d’un transducteur métabolique a permis l’activation de l'interrupteur a recombinase par la molécule d'intérêt. Ces résultats valident la faisabilité de cette approche. Les interrupteurs ainsi générés seront à présent connectés à différents transducteurs métaboliques permettant la conversion de biomarqueurs d’intérêt (e.g. sarcosine).

Parmi les biomarqueurs établis du cancer de la prostate figurent aussi de l’ANR non-codante, en particulier le PCA3. Alors que nous n’avions pas prévu ce type d’étude dans notre projet initial, un biocapteur de type “toehold switch” qui permet la détection de l’ARN PCA3 a également été mis au point pour à terme être couplés avec les autres biocapteurs précédemment développés. Ce nouveau développement a nécessité l’utilisation d’approches bio-informatiques pour mettre au point des détecteurs d’ARN séquence spécifique régulant la traduction in vivo ou in vitro et permettant une détection de marqueurs transcriptionnels du PCa.

Nous avons aussi commencé à développer une série de dispositifs hybrides intégrant l’information de concentration provenant de plusieurs types de molécules (ARN, métabolite et protéines) ceci pour la détection de molécules modèles (dérivés du benzoate) et de biomarqueurs du PCa. En particulier, nous avons mis au point une méthode pour construire des additionneurs pondérés sur systèmes acellulaires. Ces additionneurs pondérés ont permis de développer un perceptron (unité de base des systèmes réseaux neuronaux artificiels) pour classifier des échantillons à partir de leurs compositions métaboliques. Alors que ce travail, publié dans Nature Communication, a été exemplifié sur un système modèle, il est en cours d’implémentation pour la détection multiplex de biomarqueurs du PCa (sarcosine, lactate, PCA3, lactate dehydrogenase/LDH).

Pandi A, Koch M, Voyvodic PL, Soudier P, Bonnet J, Kushwaha M*, Faulon JL*. Metabolic Perceptrons for Neural Computing in Biological Systems. Nature Communications, 10: 3880, 2019. | doi: 10.1038/s41467-019-11889-0

Batista A, Soudier P, Kushwaha M, Faulon JL*. Optimizing protein synthesis in cell-free. IET Engineering Biology, 5(1): 10-19, 2021. | doi: //doi.org/10.1049/enb2.12004
Voyvodic PL and Bonnet J. Cell-free biosensors for biomedical applications. Current Opinions in Biomedical Engineering 13: 9-15, 2020.

Pandi A., Borkowski O., Faulon JL. (2020) Synthetic Biology at the Hand of Cell-Free Systems. In: Singh V. (eds) Advances in Synthetic Biology. Springer, Singapore | doi.org/10.1007/978-981-15-0081-7_2

Du nouveau dans l’apprentissage automatique via des systèmes biologiques, INRAe/INSERM communiqué de presse, 16/09/2019, www.inrae.fr/actualites/du-nouveau-lapprentissage-automatique-systemes-biologiques

Les organismes ont évolué pour détecter des métabolites et ces capacités de détection sont utilisées par l’homme depuis fort longtemps. Récemment, la biologie de synthèse a étendu et rationalisé la biodétection avec l'ingénierie de biocapteurs cellulaires. Les principaux avantages des biocapteurs cellulaires par rapport à la détection abiotique basée sur des anticorps, l'hybridation d'acide nucléique ou l'analyse métabolomique sont : des coûts moins élevés, une meilleure stabilité et la possibilité d'être utilisés directement dans les lieux de soins ou à domicile chez les patients.

Ce projet vise à mettre en place une plateforme de développement de biocapteurs cellulaires programmable et évolutive pour la détection multiplexée de biomarqueurs dans des échantillons cliniques. Afin d’illustrer cette technologie, nous avons choisi la détection de biomarqueurs de maladies chroniques (cancer, schrizophénie, insuffisance rénale, urémie). Nos biocapteurs cellulaires seront évalués sur des échantillons cliniques de patients du CHU de Montpellier.

La technologie des biocapteurs cellulaires pour la clinique est pertinente car les partenaires du projet ont récemment résolu deux principaux goulets d'étranglement limitant son application : (i) l'augmentation du nombre d'analytes qui peuvent effectivement être détectés et (ii) l’augmentation de la fiabilité du fonctionnement des biocapteurs dans des fluides physiologiques complexes.

La plupart des biocapteurs actuels ne sont activés que par une demi-douzaine de signaux d'entrée. Pour pallier cette lacune, le partenaire MICALIS a récemment élargi la palette de molécules biologiquement détectables en concevant et en développant systématiquement des voies métaboliques qui transforment des substances chimiques non détectables en molécules pour lesquelles des capteurs existent déjà. La méthode a été testée avec succès pour l'ingénierie de biocapteurs permettant de détecter des polluants, des médicaments et des biomarqueurs tels que l'acide benzoïque et l'acide hippurique.

L'autre défi limitant le déploiement des biocapteurs est leur fonctionnement peu fiable avec un faible rapport signal sur bruit dans des échantillons complexes et hétérogènes. Le partenaire CBS a résolu ce problème en développant une plateforme de traitement du signal qui utilise des amplificateurs génétiques. Le CBS a démontré la détection d'une glycosurie anormale dans l'urine de patients diabétiques. Ce travail, publié dans Science Translational Medicine, valide la capacité opérationnelle de la technologie dans les échantillons cliniques.

Dans le présent projet, nous proposons de combiner les avantages des développements récents ci-dessus en détectant des biomarqueurs par des voies métaboliques synthétiques agissant comme des dispositifs analogiques en déclenchant une réponse numérique en utilisant des circuits génétiques fonctionnant de manière robuste dans des échantillons cliniques. Un tel système hybride analogique/numérique n'a pas encore été développé pour les biocapteurs.

Nos biocapteurs seront mis en œuvre dans des bactéries et dans des systèmes acellulaires sur papier. Les capteurs bactériens peuvent contenir des circuits de détection complexes, ils n'ont pas besoin de ressources coûteuses et sont bon marché à produire. Cependant, les biomarqueurs toxiques ou ne pouvant pas traverser la membrane cellulaire peuvent s'avérer difficile à détecter. Nous proposons donc de tester nos constructions dans des systèmes acellulaires, dépourvus de membrane mais disposant de toute la machinerie de transcription et traduction. Dans de tels systèmes, les biocapteurs peuvent être stockés après lyophilisation, les circuits de détection peuvent être facilement optimisés en changeant simplement la quantité d'ADN codant pour les différentes fonctions et finalement, les systèmes acellulaires étant abiotiques leurs réglementation et acceptation s’en trouvent simplifiées.